Метасульфан для лечения пчел: Метасульфан- инструкция по применению препарата

Метасульфан- инструкция по применению препарата

Назначение

Препарат для профилактики и лечения гнильцовых заболеваний пчел.

Форма

Порошок белого цвета.

Состав

В состав препарата входят три антибиотика широкого противомикробного спектра действия, обладающих высокой активностью против возбудителей американского и европейского гнильца: сульфомеразин, сульфометаксазол, триметаприм.

Применение препарата Метасульфан

Для профилактики бактериозов пчелиного расплода препарат применяется весной после облета пчел. Для лечения заболевших семей препарат применяется сразу же после появления признаков поражения расплода гнильцовой инфекцией.

Способ применения и дозировка

1. В виде водного раствора, путем опрыскивания сотов с пчелами, расплодом и без него. Рабочий раствор препарата готовят путем растворения содержимого 1-го флакона в 1-ом литре теплой (60°С-70°С) кипяченой воды. При опрыскивании гнезда пчел нормы расхода рабочего раствора препарата 10 мл. на 1 рамку с пчелами. Для профилактики достаточно 1-ой обработки пчелиного гнезда. Для лечения заболевших пчел обработку проводят повторно через каждые 4 дня до полного исчезновения признаков заболевания. Содержимое одного флакона используется для обработки 100 рамок с пчелами и расплодом.

2. В виде лечебной подкормки 50%-ым сахарным сиропом с добавлением препарата. Лечебный сироп готовят путем растворения содержимого 1-го флакона препарата в 10 литрах 50%-го сахарного сиропа. Лечебный сироп скармливается пчелам при помощи кормушек или наливается непосредственно в соты и устанавливается в середину гнезда. На 1-ну рамку с пчелами скармливается 100 мл. лечебного сиропа. Для профилактики гнильцовых заболеваний достаточно однократного скармливания лечебного сиропа. Для лечения заболевших пчел кормление пчел лечебным сиропом проводят с интервалом 5-7 дней до полного исчезновения признаков заболевания.

3. В виде лечебного канди. Лечебный канди приготавливают путем тщательного размешивания 5 кг. канди с содержимым 1-го флакона препарата. Лечебный канди дается пчелам в виде подкормки из расчета 50 г. на 1-ну рамку с пчелами. Для профилактики гнильцовых заболеваний достаточно однократного скармливания лечебного канди. Для лечения заболевших пчел кормление пчел лечебным канди проводят с интервалом 5-7 дней до полного исчезновения признаков заболевания.

Преимущества

Комплекс действующих веществ препарата обладает пролонгированным действием, что обеспечивает защиту пчел и личинок от повторного заражения между лечебными обработками и обуславливает высокую эффективность препарата при лечении бактериальных инфекций пчелиного расплода

Форма выпуска

Флаконы по 10 г препарата.

Условия хранения препарата Метасульфан

Хранить в сухом, защищенном от света месте, при комнатной температуре.

Меры безопасности

Обработку препаратом производить, не допуская попадания рабочего раствора в глаза и дыхательные пути. Исключить доступ к препарату детей и посторонних лиц.

Ссылка на сайт производителя: www.ooo-unipharm.ru

Метасульфан инструкция по применению

Здравствуйте, дорогие друзья. Сегодня я к вам с плохой новостью.

Недавно я обнаружил в своих ульях гнильцовую инфекцию, которой уже был поражен расплод.

Причем зараженными оказалось сразу несколько пчелосемей. На выручку мне пришел метасульфан – препарат нового поколения, отлично подходящий и для лечения, и для профилактики. Он продается в ветеринарных аптеках и специализированных магазинах для пчеловодов в виде мелкодисперсионного порошка белого цвета.

Состав

В его состав входит сразу 3 антибиотика – сульфометаксозол, сульфомеразин и триметаприм, комплексно воздействующие на инфекцию. Благодаря метасульфану я не только быстро избавился от возбудителя гнильца, но и обеспечил надежную защиту пчелам и расплоду от повторного заражения. Об этом чудо-препарате я и хочу поговорить с вами более подробно.

Особенности препарата

Метасульфан – это препарат №1 для пчел, его обязательно нужно купить и начинающим, и опытным пчеловодам. Цена этого антибактериального средства не велика, а эффект, который он дает, сложно не оценить. Я рекомендую применение этого препарата не только для лечения, но и для профилактики гнильцовой инфекции.

Я обрабатываю им улья весной, сразу после облета пчел. Это предупреждает инфицирование расплода. Если же заражение все же произошло, тогда действовать нужно незамедлительно. Метасульфан всегда должен быть у вас под рукой, применять его следует сразу после обнаружения первых признаков поражения пчел и личинок гнильцовой инфекцией. Преимущества использования этого препарата очевидны. К ним можно отнести:

Доступную стоимость, делающую метасульфан доступным даже начинающим пчеловодам;

Эффективность против возбудителей американского и европейского гнильца;
Пролонгированное действие, обеспечивающее пчелам и расплоду надежную защиту от инфицирования.
Отзывы от моих подписчиков о метасульфане поступают только в положительном ключе. При работе с ним нужно придерживаться инструкции производителя.

Порядок применения

 

Метасульфан для лечения и профилактики гнильцовых заболеваний пчел и расплода подходит для применения в наших широтах. Его можно использовать в трех формах:

Водный раствор для опрыскивания пораженных гнильцом ульев, рамок с расплодом и без него. Он готовится из расчета 1 флакон на 1 литр теплой кипяченой воды. Его хватит для обработки 100 рамок. Для профилактики бывает достаточной 1 обработки, а для лечения – выполнять опрыскивания 1 раз в 4 дня до полного исчезновения всех признаков гнильцовой инфекции.

Рецепт приготовления

Лечебная подкормка. Для ее приготовления вам понадобится 1 флакон препарата к 10 литрам 50% сахарного сиропа. Подкормка раскладывается по кормушкам или наливается в соты, из расчета 100 грамм лечебного сиропа на 1 рамку.
Лечебный канди. 5 кг канди размешивается с 1 флаконом метасульфана. Подкормка пчел осуществляется из расчета 50 гр на 1 рамку.
Для профилактики гнильца подкормить пчел лечебной смесью достаточно 1 раз, а для лечения – каждые 5-7 дней до окончательного устранения инфекции.

На этом все, друзья,

будьте внимательны к своим крылатым питомцам

. А если вам понравилась моя статья, не забудьте поделиться ею в социальных сетях. Она будет полезна и опытным, и начинающим пасечникам.

Фумагол инструкция по применению для пчёл

Здравствуйте, друзья!

Знаю, что многим из вас, и мне, в том числе, приходилось сталкиваться с такой напастью, как нозематоз – инфекционным заболеванием пчел, которое, если своевременно не принять меры, может полностью погубить пасеку. Одним из распространенных препаратов, предназначенных для обработки ульев, насекомых и инвентаря является Фумагол, инструкция по применению которого есть в свободном доступе в интернете.

Сегодня я вам предлагаю подробно разобраться с тем, что это за препарат и каковы преимущества его использования на приусадебной пасеке.

Что представляет собой Фумагол?

Фумагол – это лучший препарат для пчел, страдающих нозематозной инфекцией. Его активными веществами выступают метронидазол и тимол, что обеспечивает ему выраженные противопротозойные и антибактериальные свойства. Инструкция по применению данного препарата содержит подробные рекомендации по его использованию для лечения и профилактики нозематоза пчел.

Фумагол, как и большинство подобных препаратов, в профилактических целях лучше всего использовать осенью в составе укрепляющей подкормки для тружеников-насекомых. Этим препаратом лечить пчел рекомендуется весной, сразу после первого облета. Его можно использовать в качестве:

1. Водного раствора для опрыскивания зараженных пчелосемей, ульев и пасечного инвентаря;
2. Лечебной подкормки с 50% сахарным сиропом;
3. Лечебного канди.

Для приготовления раствора, подкормки и канди для лечения нозематоза пчел нужно строго соблюдать пропорции лекарственного средства и дополнительных ингредиентов, указанных в инструкции.

Преимущества Фумагола в лечении нозематоза пчел

Современные производители предлагают большой выбор средств, предназначенных для лечения нозематоза. Я же вам предлагаю, друзья, купить Фумагол для осенней профилактики, которую мы с вами начнем проводить очень скоро. К неоспоримым преимуществам этого препарата относится:

1. Высокая эффективность;
2. Доступная цена;
3. Нетоксичность – препарат не оказывает ни малейшего влияния ни на взрослых особей, ни на расплод, ни на собранные пчелопродукты;
4. Способствование интенсивному весеннему развитию пчелосемей;
5. Отсутствие влияния на репродуктивную способность матки.

Фумагол не только прост, но и экономически выгоден в применении. Всего 1 флакона этого препарата вам будет достаточно для профилактической обработки пасеки от ноземы. Одним словом, друзья, Фумагол я рекомендую вам применять уже в этом году для осенней профилактической подкормки наших крылатых питомцев. Весной вы будете приятно удивлены тому, насколько крепкими после продолжительной зимовки окажутся ваши пчелосемьи.

На этом у меня все, я прощаюсь с вами, до завтра. До новых встреч в моем блоге, не забывайте подписываться на обновления. Впереди у нас еще много интересных тем, которые будут вам полезными.

 

 

 

Метасульфан (10 гр.)

Кристаллический порошок белого цвета.

 

СОСТАВ: лекарственное средство содержит 2% сульфамонометоксина, 2% триметоприма, 5% сульфамеразина.

 

СВОЙСТВА: входящие в состав препарата активные компоненты, проявляют синергизм действия и оказывают выраженный антибактериальный эффект на широкий спектр грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов вызывающих гнильцовые заболевания расплода пчел.

 

ПРИМЕНЕНИЕ ПРЕПАРАТА: для профилактики бактериозов пчелиного расплода препарат применяется весной после облета пчел. Для лечения заболевших семей препарат применяется сразу же после появления первых признаков заболевания.

 

СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ И ДОЗИРОВКА:

 

В виде водного раствора, путем опрыскивания сотов с пчелами, расплодом и без него. Рабочий раствор препарата готовят путем растворения содержимого 1-го флакона в 1 литре теплой (60-70°С) кипяченой воды. При опрыскивании гнезда пчел нормы расхода рабочего раствора препарата 10 мл на 1 рамку с пчелами. Для профилактики гнильцовых заболеваний достаточно однократной обработки пчелиного гнезда. Для лечения заболевших пчел обработку проводят повторно через каждые 4 дня до полного исчезновения признаков заболевания. Содержимое одного флакона препарата (10 г) используется для обработки 100 рамок с пчелами и расплодом.

 

В виде лечебной подкормки 50% сахарным сиропом с добавление препарата. Лечебный сироп готовят путем растворения содержимого 1 флакона препарата (10 г) в 10 литрах 50% сахарного сиропа Лечебный сироп скармливается пчелам при помощи кормушек или наливается непосредственно в пустые соты, которые устанавливаются в расплодную часть гнезда. На одну рамку с пчелами скармливается 100 мл лечебного сиропа. Для профилактики гнильцовых заболеваний достаточно однократного скармливания лечебного сиропа. Для лечения заболевших пчел подкормку пчел сахарным сиропом с препаратом производят с интервалом 5-7 дней до полного исчезновения признаков заболевания. Содержимое одного флакона (10 г.) используется для обработки 100 рамок с пчелами.

 

В виде лечебного канди. Лечебный канди приготавливают путем тщательного перемешивания 10 г препарата (1 флакон) препарата с 5 кг канди. Лечебный канди дается пчелам в виде подкормки из расчета 50 г на 1 рамку покрытую пчелами. Для профилактической обработки достаточно одноразового скармливания лечебного канди. Для лечения пчел скармливание лечебного канди проводят с интервалом 5-7 дней до полного исчезновения признаков заболевания. Содержимое одного флакона препарата используется для обработки 100 рамок плотно покрытых пчелами.

 

Препарат не токсичен для пчел и расплода всех возрастов. Не влияет отрицательно на репродуктивную функцию маток; не ухудшает биологическое и санитарное качество продуктов пчеловодства. Способствует интенсивному весеннему и осеннему развитию пчелиных семей.

 

ФОРМА ВЫПУСКА: Препарат выпускается во флаконах по 10 г препарата в каждом флаконе. Вторичная упаковка: картонная коробка с нанесенной на нее информацией о препарате. Каждый флакон снабжается инструкцией по применению препарата.

 

УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ: хранят препарат в плотно закрытой заводской упаковке, защищенной от попадания прямых солнечных лучей при температуре окружающей среды. Не допускается хранение препарата в помещении, доступном для посторонних лиц. Срок хранения препарата 2 года.

 

МЕРЫ БЕЗОПАСНОСТИ: действующие вещества препарата «Метасульфан» относятся к группе нетоксичных для человека, однако при работе с препаратом необходимо соблюдать определенные меры предосторожности. Исключить доступ к препарату детей и посторонних лиц. Все работы следует проводить в спецодежде (халат, резиновые перчатки, защитные очки). Во время работы запрещается курить, пить и принимать пищу. При случайном попадании препарата в глаза или на кожу, их следует немедленно промыть обильным количеством проточной воды. После работы следует тщательно вымыть лицо и руки теплой водой с мылом, вымыть и просушить перчатки.

Фумагол

Представляет собой кристаллический порошок белого или слегка желтоватого цвета с запахом хвои.

 

СОСТАВ: препарат содержит метронидазол и тимол.

 

СВОЙСТВА: действующие вещества препарата «Фумагол» в оптимальных концентрациях активны против возбудителя инфекционного поноса пчел микроспоридии, при применении осенью, во время подготовки к зимовке пчел, препарат действует обеззараживающее и общеукрепляющее на кишечный тракт пчел. Препарат применяют также для профилактики нозематоза.

 

ПРИМЕНЕНИЕ ПРЕПАРАТА: препарат применяется для профилактики и лечения нозематоза пчел.

 

СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ И ДОЗИРОВКА: в виде водного раствора путем опрыскивания из мелкодисперсного распылителя («Росинка») сотов с пчелами и расплодом. Рабочий раствор препарата готовят путем растворения содержимого 1-го флакона (5 г) в 3 литрах кипяченой воды (60°С-70°С) При опрыскивании гнезда пчел, нормы расхода рабочего раствора препарата 10 мл на одну рамку с пчелами. Для лечения пчел от нозематоза обработку проводят 3-х кратно с интервалом 2-3 дня. Один флакон препарата(5 г) используется для лечебной обработки 300 рамок с пчелами и расплодом. В виде лечебной подкормки 50%-ым сахарным сиропом с добавлением препарата. Лечебный сироп готовят путем растворения 1 флакона (5 г) препарата в 25 литрах сахарного сиропа. При приготовлении сиропа сначала растворяется в горячей воде препарат, а затем сахар. Раздают лечебный сироп вечером в потолочные кормушки или пустые соты. Для профилактики нозематоза сахарный сироп скармливается пчелам по 50 мл на 1 рамку с пчелами. Кормление производят 6 кратно с интервалом 1-2 дня. Для лечения пчел больных нозематозом лечебный сироп скармливается из расчета 100 мл на 1 рамку с пчелами 3-х кратно с интервалом 1-2 дня. Содержимое 1-го флакона препарата используется для лечебной обработки 250 рамок с пчелами. В виде лечебного канди. Лечебный канди приготавливают путем тщательного перемешивания 5 граммов препарата (1 флакон) с 10 кг сахарно-медового канди. Лечебный канди дается пчелам в виде подкормки из расчета 50 г на 1 рамку по крытую пчелами, лечебный канди скармливается пчелам однократно, 1 флакон препарата используется для лечебной обработки 200 рамок с пчелами.

 

ПРЕИМУЩЕСТВА: препарат не токсичен для пчел и расплода всех возрастов. Не влияет отрицательно на репродуктивную функцию маток, не ухудшает биологическое и санитарное качество продуктов пчеловодства. Способствует интенсивному весеннему и осеннему развитию пчелиных семей.

 

ФОРМА ВЫПУСКА: препарат выпускается во флаконах из стекла емкостью 10 мл. Вторичная упаковка: картонная коробка с нанесенной на нее информацией о препарате. Каждый флакон снабжается инструкцией по применению препарата.

 

УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ: хранят препарат в плотно закрытой заводской упаковке, защищенном от попадания прямых солнечных лучей месте, при температуре от 5°С до 25°С. Не допускается хранение препарата в помещении, доступном для посторонних лиц. Срок хранения препарата 2 года.

 

МЕРЫ БЕЗОПАСНОСТИ : исключить доступ к препарату детей и посторонних лиц. Все работы следует проводить в спецодежде (халат, резиновые перчатки, защитные очки). Во время работы запрещается курить, пить и принимать пищу. При случайном попадании препарата в глаза или на кожу, их следует немедленно промыть обильным количеством проточной воды. После работы следует тщательно вымыть лицо и руки теплой водой с мылом, вымыть и просушить перчатки.

Метасульфан по цене 95 руб.

Эффективный антибиотик для лечения и профилактики гнильцовых заболеваний пчел.

Состав

В составе препарата - три антибиотика широкого противомикробного действия, обладающие высокой активностью против возбудителей гнильца: сульфомеразин, сульфометаксазол, триметаприм.

Применение

Для профилактики бактериального поражения пчелиного расплода препарат применяют весной после облета пчел. Для лечения уже заболевших семей препарат необходимо применять сразу же после появления первых признаков поражения расплода. Способы применения:

• В виде водного раствора. Полученным раствором опрыскивают соты с пчелами, расплодом и без него. Рабочий раствор готовят так: растворяют содержимое 1 пакета в 1 л горячей (60-70°С) кипяченой воды. При опрыскивании нормы расхода рабочего раствора препарата составляют 10 мл на 1 пчелиную рамку. Для профилактики достаточно единоразовой обработки гнезда. Для лечения зараженных пчел обработку повторяют через каждые 4 дня вплоть до полного исчезновения признаков заражения. Содержимого одного пакета достаточно, чтобы обработать 100 рамок с пчелами и расплодом.
• В виде лечебной подкормки. Препарат соединяют с 50%-ым сахарным сиропом. Лечебный сироп готовят так: растворяют содержимое 1 пакета в 10 л 50%-го сахарного сиропа. Затем его скармливают пчелам в кормушках или наливают сразу в соты, устанавливая в середину гнезда. На каждую рамку с пчелами приходится по 100 мл лечебного сиропа. Для профилактики гнильцовых заболеваний достаточно единоразового скармливания. Для лечения уже заболевших пчел кормление лечебным сиропом проводят с интервалом в 5-7 дней до полного исчезновения признаков болезни.
• В виде лечебного канди. Готовят следующим образом: тщательно размешивают 5 кг канди с 6 г препарата. Дают как подкормку из расчета 50 г на каждую рамку с пчелами. Для профилактики гнильца достаточно единоразового скармливания лечебного канди. Для лечения заболевших пчел кормление обогащенным канди проводят с интервалом в 5-7 дней до полного исчезновения проявлений заболевания.

Хранение

Хранить в сухом, защищенном от света месте, при комнатной температуре.

Меры безопасности

При обработке препаратом нельзя допускать попадания рабочего раствора в глаза и дыхательные пути. Исключить доступ к препарату детей и посторонних лиц. Использовать защитную одежду.

Примечание

Препарат применяют до начала активного медосбора и летом, после откачки меда.

Хотя соединительная ткань имеет более низкую плотность клеток, чем другие ткани, которые вы изучите в этом году, клетки этих тканей чрезвычайно важны.

Фибробласты на сегодняшний день являются наиболее распространенным типом нативных клеток соединительной ткани. Фибробласт синтезирует коллаген и основное вещество внеклеточного матрикса. Эти клетки производят большое количество белка, который они секретируют для создания слоя соединительной ткани. Некоторые фибробласты обладают сократительной функцией; их называют миофибробластами.

Хондроциты и остеоциты образуют внеклеточный матрикс хряща и кости. Более подробную информацию и хондроциты можно будет найти позже в этой лаборатории; Остеоциты будут обследованы в лаборатории по костям.

Макрофаг - это соединительная ткань, представляющая ретикулоэндотелиальную или мононуклеарную систему фагоцитов. Эта система состоит из ряда тканеспецифичных, подвижных фагоцитарных клеток, которые происходят от моноцитов - к ним относятся клетки Купфера печени, альвеолярные макрофаги легкого, микроглия центральной нервной системы и ретикулярные клетки селезенка.Позже вы встретитесь с каждым из них; А пока убедитесь, что вы понимаете, что все они происходят от моноцитов и что макрофаг - это версия соединительной ткани. Макрофаги неотличимы от фибробластов, но их можно распознать, когда они усваивают большое количество видимых индикаторных веществ, таких как красители или частицы углерода. Макрофаги фагоцитируют чужеродный материал в слое соединительной ткани, а также играют важную роль в качестве антигенпредставляющих клеток, функция, о которой вы узнаете больше в иммунобиологии.

Тучные клетки - это гранулированные клетки, обычно встречающиеся в соединительной ткани. Эти клетки опосредуют иммунные ответы на инородные частицы. В частности, они высвобождают большое количество гистамина и ферментов в ответ на распознавание антигена. Этот процесс дегрануляции является защитным, когда инородные организмы вторгаются в организм, но также является причиной многих аллергических реакций.

Белые жировые клетки предназначены для хранения триглицеридов и встречаются по отдельности или небольшими группами, разбросанными по рыхлой соединительной ткани.Они особенно распространены на более мелких кровеносных сосудах. Когда жировые клетки накапливаются в таком количестве, что вытесняют или замещают клеточные и волокнистые элементы, такое накопление называется жировой тканью. Эти клетки могут вырастать до 100 микрон и обычно содержат некогда центрально расположенную липидную вакуоль - цитоплазма образует круговое кольцо вокруг этой вакуоли, а ядро ​​сжимается и смещается в сторону. Функция белого жира - служить источником энергии и теплоизолятором.

Клетки коричневого жира очень специализированы для регулирования температуры. Этих клеток много у новорожденных и млекопитающих, находящихся в спячке, но редко у взрослых. У них есть многочисленные липидные капли меньшего размера и большое количество митохондрий, цитохромы которых придают ткани коричневый цвет. Цепь переноса электронов в этих митохондриях нарушается разобщающим белком, который вызывает диссипацию митохондриального градиента ионов водорода без производства АТФ. Это выделяет тепло.

Границы | Генная терапия с использованием плазмидной ДНК, кодирующей гены VEGF164 и FGF2: новое лечение естественно возникающих тендинитов и десмитов у лошадей

Введение

Самыми частыми причинами ортопедических нарушений у лошадей являются травмы сухожилий и связок, которые считаются заболеванием, ограничивающим карьеру. Было подсчитано, что, например, на ипподромах Соединенного Королевства 46% всех травм приходится на травмы сухожилий или связок (Pinchbeck et al., 2004). Повреждения SDFT и SLB имеют огромное клиническое значение для лошадей из всех случаев, наблюдаемых в практике лошадей (Kovac et al., 2002).

Реакция заживления после травм сухожилий / связок (T / L) лошади предсказуема. Ответ традиционно был разделен на три перекрывающиеся стадии, классифицируемые как воспаление, пролиферация / восстановление и ремоделирование. Острая воспалительная фаза (продолжительностью менее 10 дней) включает фагоцитоз поврежденной ткани сухожилия и демаркацию поврежденной ткани сухожилия. Между 2 и 4 днями после травмы начинается пролиферативная или репаративная фаза, которая может длиться примерно 45 дней.Основная наблюдаемая проблема заключается в том, что на ранних стадиях заживления сухожилий в матриксе, синтезируемом теноцитами, наблюдается повышенное количество коллагена III типа (Juneja et al., 2013). Коллаген типа III состоит из волокон меньшего размера по сравнению с типом III и имеет пониженную способность к эластичности и прочности (Sodersten et al., 2013). Коллагеновые фибриллы примерно через 45 дней после травмы организуются в связки сухожилий во время фазы ремоделирования, которая сама по себе часто разделяется на фазы консолидации и созревания.Во время фазы ремоделирования теноциты и волокна коллагена выравниваются в направлении стресса. Уменьшение коллагена типа III наблюдается с сопутствующим повышением коллагена типа I, а также наблюдается снижение клеточности и содержания гликозаминогликанов (Sharma and Maffulli, 2006).

Из-за высокой частоты травм T / L у лошадей, высокой частоты повторных травм и длительного периода восстановления, который обычно длится несколько месяцев и длится до 15 месяцев при тяжелых травмах, эти нарушения представляют собой реальную проблему.За прошедшие годы был разработан и применен ряд достижений в области физиотерапии, медицинских, регенеративных и хирургических вмешательств, однако этих стратегий часто недостаточно для восстановления функциональных, структурных и биохимических свойств восстановленного T / L у лошадей по сравнению с теми, которые наблюдаются в естественных условиях. ткань. Во многих случаях восстановленная ткань сухожилия остается биохимически и ультраструктурно аномальной даже через 12 месяцев и не полностью восстанавливает биомеханические свойства, которые были до травмы (Yang et al., 2013). При использовании лекарственной терапии для лечения травм сухожилий лошадей более чем в 43% случаев заболевание рецидивирует при интенсивных физических нагрузках (Dyson, 2004). Несмотря на многообещающие методы регенеративной медицины, такие как использование мезенхимальных стволовых клеток, полученных из аутологичного костного мозга и жировой ткани, а также богатой тромбоцитами плазмы (Godwin et al., 2012; Middleton et al., 2012; Uysal et al., 2012; Kovac et al., 2016; Witte et al., 2016), которые продолжали расти с момента их создания более 10 лет назад, перевод исследований экспериментальных моделей в клинические методы лечения серьезных повреждений T / L у лошадей был удручающе медленным.

Сухожилие лошади представляет собой относительно плохо васкуляризованную ткань. Во время повреждения сухожилия, которое характеризуется очаговой гипоцеллюлярностью, дегенерацией коллагеновых фибрилл, ишемией и аноксией фибробластов, сосудистая система необходима для инфильтрации клеток, которая, в свою очередь, обеспечивает необходимые репаративные факторы для заживления тканей (Docheva et al., 2015) . Теноциты и их внеклеточный матрикс в виде субъединиц, называемых пучками, окружены небольшими количествами рыхлой соединительной ткани, называемой эндотеноном.Эндотенон несет кровеносные сосуды, которые в нормальных условиях не проникают в фасцикулярное вещество (Fenwick et al., 2002). Процесс ангиогенеза контролируется множеством митогенных, хемотаксических или ингибирующих пептидов и липидных факторов (Snedeker and Foolen, 2017). Одна из целей нашего исследования состояла в том, чтобы исправить эту фундаментальную проблему у лошадей, стимулируя неоваскуляризацию / ангиогенез, тем самым обеспечивая необходимые репаративные факторы в течение раннего периода заживления сухожилий.С этой целью был использован подход генной терапии с использованием VEGF164 и FGF2.

Было высказано предположение, что «использование рекомбинантных белков и генная терапия являются наиболее продвинутыми и многообещающими подходами к лечению скелетно-мышечных заболеваний в медицине человека» (Martinek et al., 2005). Ангиогенез необходим для регенерации ткани, поэтому целенаправленное манипулирование этой сетью может открыть уникальные возможности для регенеративной ветеринарии. Мы использовали плазмидную ДНК, содержащую FGF2 и VEGF164, поскольку они, как известно, способствуют регенерации мягких тканей.FGF играет второстепенные роли на стадиях воспаления и ремоделирования, но главные роли на стадиях пролиферации / репарации и индуцирует экспрессию VEGF - ключевой фактор в регуляции нормального васкулогенеза и ангиогенеза (Seghezzi et al., 1998). Несколько исследований также показали, что VEGF может повышать эффективность восстановления скелетных мышц за счет увеличения ангиогенеза и, в то же время, снижения накопления фиброза (Best et al., 2013). Плазмидную конструкцию pBUDK-ecVEGF164-ecFGF2 получали, как ранее описано для pBudCE4.1 вектор (Литвин и др., 2016).

Метод генной терапии, который мы недавно использовали на двух лошадях, которые хромали из-за повреждения поддерживающей ветви связки, и SDFT, привел к быстрому выздоровлению в течение 2–3 недель (Kovac et al., 2017). Всего за 3 месяца они вернулись к полному здоровью, скакали и соревновались. Целью настоящего исследования было предоставить дополнительные клинические доказательства того, что однократная инъекция внутрь очага поражения плазмидной ДНК, содержащей видоспецифичные кДНК VEGF164 и FGF2, имеет долгосрочный клинический и поддающийся ультразвуковому исследованию эффект при лечении острого и подострого повреждения SLB и SDFT.Клиническая оценка и ультразвуковая визуализация через 12 месяцев наблюдения использовались на большем количестве лошадей (всего 10) для оценки скорости регенерации сухожилий и связок и подтверждения безопасности этой генной терапии. Кроме того, CDU использовался, чтобы понять сосудистую сеть пораженных областей, чтобы лучше понять механизм действия генной терапии.

Материалы и методы

Дизайн исследования

Десять лошадей с естественными SDFT и SLB-поражениями были включены в исследование с 2015 по 2017 год и проходили лечение в Конной клинике - Новый век Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии, Москва.В исследование были включены семь лошадей со средним и тяжелым тендинитом SDFT и три лошади с десмитом SLB. Лошади, включенные в это исследование, должны были соответствовать следующим критериям до включения в исследование: острый и подострый тендинит SDFT или десмит SLB, который показал определяемое ультразвуком гипоэхогенное поражение, занимающее> 12% CSA в максимальной зоне повреждения в интактном паратеноне, и серьезность аномальной эхогенности и совмещения волокон, при которой обе оценки были 3 или выше по шкале от 0 до 4.Кроме того, лошади включались только в том случае, если клиенты давали информированное согласие и если лошади не получали ранее внутрижильных инъекций.

Владелец сообщил, что продолжительность от травмы лошади до первоначального осмотра и лечения в клинике для лошадей составила 16,05 дня (± 14,23) и варьировала от 3 до 45 дней (Таблица 1). Все лошади были взрослыми от следующих пород: 3 ганноверских, 2 тракененских, 1 голландская теплокровная, 1 андалузская, 1 русская верховая лошадь, 1 орловский рысак и 1 лошадь Буденного.В исследование были включены 6 мелей, 2 кобылы и 2 жеребца. Средний возраст лошадей составлял 9,8 года (± 2,78) и колебался от 6 до 15 лет. Участвующие лошади в основном использовались для выездки (8 случаев), но одна использовалась для прыжков, а другая была лошадью для удовольствия / верховой езды (Таблица 1).

ТАБЛИЦА 1. Описание, история болезни и диагностические данные 10 лошадей до лечения плазмидной ДНК, кодирующей гены VEGF164 и FGF2.

Перед лечением все лошади прошли клиническое обследование (степень хромоты), включая периневральное или внутрисуставное, для точной локализации поражения.Хромоту оценивали на лошадях, идущих и бегающих рысью в руке по прямой линии, а также при выпаде на твердых и мягких поверхностях. Все наблюдения и определения проводились одним и тем же ветеринаром (М.К.) и всегда проводились на одной и той же поверхности земли. Диагностика хромоты проводилась и оценивалась по шкале от 0 до 5 только с использованием шкалы AAEP, где оценка 0 означает звукоизоляцию, а оценка 5 указывает на несущую способность без нагрузки. Также отслеживали признаки воспаления в ладонной пястной / подошвенной плюсневой области (температура поверхности кожи, отек и болезненная чувствительность при пальпации).У этих лошадей с тендинитом SDFT и десмитом SLB не было обнаружено клинически значимых результатов рентгенографических исследований проксимальных сесамовидных костей или любых других суставов хромой конечности.

Ультрасонографическое исследование

Ультрасонографическое исследование T / L лошади было выполнено с использованием линейного преобразователя с частотой 7,5 МГц (Logiq 5, GE Healthcare, WI, США) после рутинного клипирования. Тип поражения T / L определяли на поперечных изображениях в MIZ (центральное поражение = центрально расположенное, очаговое гипо- / безэхогенное место; краевое поражение = периферическое расположение, очаговое гипо- / анэхогенное место; диффузное поражение = гомогенные или гетерогенные изменения в эхогенность всей / большей части площади поперечного сечения).Использовалась модифицированная ультразвуковая классификация SDFT (Rantanen et al., 2003) с оценкой следующих параметров: общая площадь поперечного сечения (T-CSA в мм ² ), общий процент площади поперечного сечения поражения ( T-CSA-L%; площадь поражения / площадь сухожилия × 100), T-ES и T-FAS. T-CSA был рассчитан путем суммирования CSA SDFT в 6 различных зонах (от 1A до 3B). Общий процент поражения рассчитывали следующим образом: (T-CSA-L / T-CSA) × 100. Тяжесть поражения сухожилий или связок оценивалась ультразвуковым методом с использованием критериев: легкое 0-15 из CSA-L%, среднее 16 –25 CSA-L% и тяжелая> 25 CSA-L%.Эхогенности присваивалась оценка 0 (нормэхогенная), 1 (гипоэхогенная), 2 (смешанная эхогенность) или 3 (безэхогенная), а выравнивание волокон оценивалось в соответствии с расчетным процентом параллельных пучков волокон в поражении: 0 (> 75% ), 1 (50–74%), 2 (25–49%) и 3 (<25%). Баллы для всех уровней были суммированы для расчета общей оценки эхо-сигнала и T-FAS соответственно.

Ультразвуковая оценка SLB проводилась с ладонно-медиальной и ладонно-латеральной сторон обеих конечностей.Три эквидистантных поперечного и продольного изображения были получены для ветвей SL и на уровне сесамовидного прикрепления. Была использована модифицированная ультразвуковая оценка поражений SLB: MIZ-CSA, процент поражения в максимальной зоне повреждения MIZ, оценка эхогенности поражения в MIZ и процент разрушения продольных волокон в MIZ, а также ультразвуковые доказательства сесамоидности. неровность или разрыв края кости на уровне прикрепления связки.

Пораженные области SDFT и SLB также оценивали с помощью CDU.Перед выполнением CDU, MIZ поражения локализовали с помощью УЗИ в B-режиме, пока конечность находилась под нагрузкой. Для выполнения CDU копыто помещали в блок Хикмана (Oxspring) с небольшим разгибанием пальца и сгибанием запястья под углом 80–90 °, чтобы избежать возможной окклюзии мелких кровеносных сосудов из-за механическим силам. Для CDU настройки были установлены на доплеровскую частоту 10 МГц и частоту повторения импульсов 1,5 кГц. Чтобы избежать артефактов, настройки были оптимизированы для низкого расхода, а доплеровское усиление было установлено чуть ниже случайного шума (VEL / 6.2 МГц; 0 Дб). Были приняты меры, чтобы минимизировать давление, оказываемое датчиком. Сухожилия исследовали в продольной плоскости в непосредственной близости от аномальных участков датчиком без зазора. Датчик находился на каждом участке не менее 30 секунд в латеральном, среднем и медиальном положениях на сухожилии, чтобы продемонстрировать максимально возможный кровоток. Записи каждого сеанса CDU сохраняли в цифровом виде в виде видеоролика для последующей оценки васкулярности DICOM в конце исследования посредством выставления баллов по полуколичественной шкале оценок.По этой шкале оценка 0 указывает на отсутствие обнаруживаемых кровеносных сосудов, оценка 1 - от одного до двух мелких сосудов, степень 2 - несколько мелких или от одного до двух более крупных сосудов, оценка 3 - несколько более крупных сосудов и диффузная васкуляризация степени 4, как описано ранее (Bosch et al. , 2011). Клиницист, не знающий о лечении, провел сбор данных, измерения были проанализированы, и ретроспективно для каждого животного была произведена средняя оценка хромоты, а также контралатеральной конечности в различные моменты времени (R.A).

Плазмидный препарат ДНК

Плазмидная ДНК pBUDK-ecVEGF164-ecFGF2 Дизайн был таким, как описано ранее (Litvin et al., 2016). Плазмидная ДНК (пДНК) содержала кодирующие последовательности Equus caballus факторов роста белка Фактор роста эндотелия сосудов А 164 (VEGFA164) и фактор роста фибробластов 2 (FGF2 / bFGF). Подготовка плазмидной ДНК проводилась GenScript в рамках услуги SC Grade, которая гарантирует чистоту конечного продукта ≥95% в суперскрученной форме с уровнем эндотоксина ≤0,03 ЕС / мг пДНК. Никаких дополнительных испытаний не проводилось для проверки чистоты продукта или процентного содержания продукта в суперспиральной форме.VEGF164 и FGF2 были клонированы в разные кассеты экспрессии под контролем разных сильных конститутивных промоторов (Litvin et al., 2016). Наша предыдущая работа продемонстрировала высокие уровни продукции рекомбинантного белка, как показали иммунофлуоресценция и вестерн-блоттинг (Litvin et al., 2016). Описание VEGFA164 и FGF2, наряду с эффективностью этих комбинаций генов, было показано в нашей предыдущей работе (Плотников и др., 2012; Литвин и др., 2016; Ковач и др., 2017).

Получение и введение плазмидной ДНК

Приготовление, хранение и введение плазмидной ДНК осуществляли, как описано ранее (Kovac et al., 2017). Короче говоря, плазмидную ДНК растворяли в 5 мл стерильного 0,9% раствора NaCl до конечной концентрации 1 мг / мл. Этот раствор хранили в холодильнике при + 4 ° в течение ночи, время от времени осторожно перемешивая и вращая. Перед введением в поврежденную ткань раствор пДНК нагревали до + 37 °. Перед лечением лошадей вводили детомидин (0,01–0,03 мг / кг внутривенно). Общий объем раствора пДНК 3,5 мл набирали в шприц, и в асептических условиях и под сонографическим контролем раствор медленно вводили с помощью иглы 22 размера в места повреждения, пока конечность находилась под нагрузкой.Заполненный объем вводили многократно в наиболее гипоэхогенные участки повреждения тканей и прилегающие нормальные ткани. пДНК вводили только один раз на животное для лечения повреждения сухожилий и связок.

Реабилитация и оценка лошадей после генной терапии плазмидной ДНК

После инъекции плазмидной ДНК на конечность накладывали повязку. Лошади были госпитализированы на 10 дней после процедуры для наблюдения, а затем выписаны. Особое внимание уделялось выявлению возможных клинических признаков местных иммунологических реакций, включая повышение температуры, отек тканей и хромоту.План реабилитации составлялся индивидуально в зависимости от тяжести травмы и результатов клинических и ультразвуковых исследований на протяжении всего процесса заживления. Была начата программа контролируемых упражнений. Мы отслеживали прогресс заживления сухожилий с измененными критериями заживления сухожилий лошади в соответствии с уже установленным методом (Gillis, 1997), используя измеримые ультразвуковые критерии, такие как процент поперечного сечения поражения, общий эхо-показатель и T-FAS.Прогресс заживления SLB также контролировали с использованием измеримых ультразвуковых критериев, таких как площадь поперечного сечения, процент поражения в максимальной зоне повреждения, оценка эхогенности поражения и оценка выравнивания волокон в максимальной зоне повреждения.

Программа лечения и реабилитации тщательно согласовывалась с процессом выздоровления. Как часто отмечалось у наших обработанных лошадей, значительные клинические и ультразвуковые улучшения наблюдались в относительно ранние периоды времени по сравнению с обычными методами заживления сухожилий (без генной терапии).В этих случаях этих лошадей мы могли быстрее продвигаться по программе упражнений по сравнению с теми, которые обычно прописывались для традиционных методов лечения, это также соответствовало ранее установленным методикам (Bosch et al., 2011; Watts et al., 2011).

После стойлового отдыха в течение первых 2 дней после обработки животных поддерживали на низком уровне физической активности (ходьба руками) в течение 3-недельного периода. Затем, когда симптомы отсутствуют, после прогрева для разминки большинство лошадей бежали в течение 1–3 минут по твердой ровной поверхности, в основном прямыми линиями, увеличивая интенсивность и продолжительность каждую неделю до тех пор, пока не войдете в полный тренировочный протокол, включая ходьбу, рысь. и скачет.Каждый компонент программы упражнений был сокращен или удлинен на основании данных ультразвукового исследования, свидетельствующих о прогрессировании заживления (т. Е. Заживлении поврежденной ткани) и степени хромоты. Специальная программа упражнений через 20 недель после введения плазмидной ДНК обычно определялась владельцем / тренером, чтобы отразить нормальную нагрузку лошади.

Последовательные клинические и ультразвуковые исследования для оценки скорости восстановления после травмы T / L и подтверждения безопасности этой генной терапии у лошадей были выполнены для всех обработанных лошадей: до лечения (день 0), каждые 20 дней в первый раз. Через 2 месяца после лечения, затем каждые 30 дней через 3-4 месяца и затем каждые 60 дней до конца исследования.При 12-месячном наблюдении также повторно оценивали степень хромоты, время, необходимое для возврата к уровню активности до травмы, и ультразвуковое исследование. Лечение считалось успешным, когда лошадь возвращалась к своему тренировочному или соревновательному уровню до травмы, без рецидива травмы в течение периода наблюдения.

Статистический анализ

Анализ данных был выполнен с помощью SPSS 15.0. Количественные данные оценивали с помощью парного теста T . Уровень значимости считался p <0.05. Все значения на графиках выражены как среднеарифметические значения со стандартными отклонениями.

Этика

Плазмидные векторы

были созданы в соответствии с человеческими стандартами, установленными Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA, 2007, 2008) и Комитетом по лекарственным средствам для использования людьми в Европейском агентстве по лекарственным средствам (EMA, 2001, 2006, 2007). Институциональный наблюдательный совет Казанского федерального университета одобрил это исследование (протокол № 3; дата 05.05.2015). Помимо институциональных комитетов Московской государственной академии и Ноттингемского университета, были соблюдены все национальные руководящие принципы.Поступившие в клинику лошади с естественными травмами и информированное согласие были даны владельцами. Этот метод ранее успешно применялся у собак (Закирова и др., 2014) и человека (Плотников и др., 2012). Инъекции и лечение проводились в соответствии со стандартными рекомендациями ветеринарной практики и проводились квалифицированными врачами с дополнительными проверками состояния здоровья и благополучия и клиническими наблюдениями. Анатомическая номенклатура соответствует Nomina Anatomica Veterinaria 2017 (ICVGAN, 2017).

Результаты

Оценка лошадей с SLB-десмопатией

У лошадей с SLB десмит проявляется краевыми поражениями (две конечности) и диффузными поражениями (одна конечность). У лошади № 3 до лечения было диффузное поражение не только ветви, но и умеренное повреждение поддерживающей связки туловища той же ноги. Во всех случаях контралатеральная конечность не имела значительных отклонений на УЗИ. Только лошадь №1 имела ультразвуковые признаки рубцевания SDFT на противоположной не хромой конечности в день 0.Перед лечением у всех трех лошадей отмечалась боль в связках при надавливании пальцами, лошадей проверяли с 0 дня до конца исследования. Через двадцать дней после лечения при надавливании пальцами на уровне травмы у лошади № 1 боли не было, к 40-му дню после лечения ни у одного из зарегистрированных животных не было признаков воспаления в ладонной пястной / подошвенной плюсневой кости в области поражения, кожи не было. перепады температуры поверхности, припухлость или болезненная чувствительность при пальпации. Одна лошадь (№1) вернулась к предтравматическому уровню спортивной активности в течение 2–6 месяцев после лечения и реабилитации и у нее не было хромоты, и она участвовала в соревнованиях по выездке с момента реабилитации до настоящего времени (на момент написания рукописи). представление).Лошадь № 2 была признана здоровой после реабилитации и вернулась к занятиям спортом, но на более низком уровне. Лошадь № 3 (SLB) оставалась хромой в течение первых 3 месяцев лечения, но было обнаружено незначительное улучшение степени хромоты и реакции на тест на сгибание, а через 90 дней хромота не была очевидна, но эта лошадь не вернулась в спорт. деятельность.

Лошади наблюдались на предмет побочных реакций с 0 дня до конца 12-месячного исследования. У 2 из 3 включенных лошадей не наблюдалось побочных реакций в результате применения пДНК.Лошадь № 2 показала незначительную неблагоприятную реакцию на 5-й день после введения пДНК. Реакция представила безболезненный отек и утолщение подкожной клетчатки в ткани, окружающей точку инъекции, отек и припухлость постепенно исчезли в течение 10 дней. До лечения, в день 0, средняя степень хромоты у исследуемых лошадей составляла 2,67 ± 0,58 (рис. 1А). В частности, лошади №1 и №3 показали высокую степень хромоты до лечения (Таблица 2). По сравнению с 0-м днем ​​хромота значительно уменьшилась к 20-му дню после лечения до 1-го дня.33 ± 0,58 ( p <0,05; рисунок 1). Через 12 недель и постоянно при последующих контрольных осмотрах при клиническом обследовании ни у одной из трех обработанных лошадей хромоты не было. Владельцев попросили оценить производительность лошадей через 12 месяцев после генной терапии. 2 из 3 владельцев оценили спортивные успехи как хорошие или отличные. Владельцы лошади № 3 (лошадь, которая показала хромоту в течение первых 3 месяцев) не могли сообщить о хороших-отличных спортивных успехах на тот момент. Возраст лошадей и продолжительность хромоты не оказали никакого влияния на клинический результат после генной терапии.Основные различия в клинических исходах наблюдались в зависимости от степени и локализации повреждения Т / Л до лечения.

РИСУНОК 1. Степень хромоты у лошадей с поражениями SLB (A) и SDFT (B) после обработки плазмидной ДНК, кодирующей гены VEGF164 и FGF2. ^∗ Указывает точку, в которой было достигнуто p <0,05 по сравнению с днем ​​0.

ТАБЛИЦА 2. Степень хромоты после лечения SLB и SDFT с течением времени.

В таблице 3 представлены ультразвуковые измерения трех лошадей с SLB-десмопатией до и после лечения плазмидной ДНК, кодирующей гены VEGF164 и FGF2. О 2 генах. На основании шкалы CSA ветвей поддерживающей связки, вовлеченной в повреждение, у лошадей № 1 и № 2 до лечения наблюдались умеренные маргинальные ан- и гипоэхогенные поражения и нарушение структуры волокон, а также увеличение и перилигаментарный фиброз в передних конечностях (верно для лошадь №1 и оставила лошадь №2).Только у лошади № 3 было повреждение левой задней конечности (таблица 3). У этой лошади отмечены диффузная измененная эхогенность SLB, плохая дифференцировка краев связок, подкожный перилигаментный эхогенный материал, а также поражение средней части тела поддерживающей связки. Во всех трех случаях с SLB desmitis контралатеральная конечность не имела существенных отклонений при ультразвуковом исследовании до лечения. На дополнительном рисунке S1 показаны ультразвуковые изображения до и после лечения. Среднее значение CSA MIZ для SLB до лечения было 1.98 см ² , а среднее значение MIZ-повреждений составило 30,44% (эти значения варьировались от 25,45 до 37,13%; Таблица 3). Показатели эхогенности и процент разрушения продольных волокон поражения в максимальной зоне повреждения до лечения в среднем составляли 3 (таблица 3).

ТАБЛИЦА 3. Результаты ультразвукового исследования у лошадей с десмитом SLB до и после лечения плазмидной ДНК, кодирующей гены VEGF164 и FGF2.

Ультразвуковые характеристики SLB-десмопатии у лошадей №1 и №2 начали улучшаться при проверках, проведенных через 20 дней после лечения, и процесс заживления постоянно поддерживался в последних наблюдениях.Это было особенно заметно по следующим параметрам:% поражения MIZ (рис. 2A), эхогенность (рис. 2B) и оценка выравнивания волокон в зоне максимального повреждения (рис. 2C). Среднее значение MIZ-CSA ветви поддерживающих связок существенно не изменилось в течение периода наблюдения (рис. 2D). Когда эти лошади начали выполнять программу упражнений, архитектура связок постоянно улучшалась, о чем свидетельствует их продольное расположение и длина (Рисунок 3). Согласно нашим наблюдениям, у лошади № 3 с десмитом SLB не наблюдалось существенного улучшения в первые 90 дней после лечения по всем ультразвуковым параметрам.На 20 и 40 дни у этой лошади появились новые гипоэхогенные поражения, указывающие на нестабильный процесс заживления. Только на 120–180-й день после лечения у этой лошади появилось заметное улучшение% поражения MIZ, эхогенности и оценки выравнивания волокон.

РИСУНОК 2. Эффекты плазмидной ДНК, кодирующей гены VEGF164 и FGF2, у лошадей с десмопатией SLB. (A) процента от общей площади поражения поперечного сечения, (B) балла эхогенности поражения, (C) баллов совмещения волокон поражения и (D) баллов площади поперечного сечения поражения. ветвь поддерживающей связки, в зоне максимального повреждения. ^* указывает точку, в которой было достигнуто p <0,05 по сравнению с днем ​​0.

РИСУНОК 3. Ультразвуковые изображения перед плазмидной ДНК, кодирующей гены VEGF164 и FGF2, в день 0 (A) , 20 (B) , 40 (C) , 90 (D) , 180 ( E) и 300 (F) после введения лошади № 2 - десмопатия SLB. Стрелки указывают на поражение.

Оценка T / L поражений с использованием CDU показала, что у большинства лошадей с SLB-десмопатией до лечения присутствовали только небольшие цветные очаги, которые ритмично мигали в области поражения.Средняя оценка цветного допплера для васкуляризации максимальной исследуемой зоны для SLB до лечения составляла 1,27 (± 0,21), это было немного выше по сравнению со здоровыми контралатеральными конечностями (0,8 ± 0,52). Показатели цветового допплера для васкуляризации максимальной исследуемой зоны для SLB конечностей после обработки плазмидной ДНК, кодирующей гены VEGF164 и FGF2, показали заметное увеличение показателей уже к 20-му дню (2,97 ± 0,93; Таблица 4 и Рисунки 4, 5). Увеличение продолжалось на 40-й день (0,03 ± 0,68), с повышенными уровнями до 90-го дня.Показатели CDU у большинства животных затем постепенно снижались до базальных показателей (как у здоровых конечностей) через 180 дней лечения, что указывает на характер кровотока, аналогичный дню 0 (рис. 4). Не наблюдалось значительной корреляции между тяжестью поражений T / L до лечения и баллами CDU после лечения. Лошадь № 2 после 20 дней лечения показала очень высокий показатель CDU, равный 4. У этой лошади, как упоминалось ранее, на 5-10 дни в месте инъекции плазмидной ДНК наблюдалась небольшая местная реакция.

ТАБЛИЦА 4. Шкала цветного допплера для васкуляризации зоны максимального запроса для SLB и SDFT после обработки плазмидной ДНК, кодирующей гены VEGF164 и FGF2.

РИСУНОК 4. Средние цветовые доплеровские баллы для васкуляризации зоны максимального запроса для (A) SLB и (B) SDFT после обработки плазмидной ДНК, кодирующей гены VEGF164 и FGF2. ^∗ означает p <0,05 по сравнению с 0 днем.

РИСУНОК 5. Поперечные и продольные цветные допплеровские ультразвуковые проекции перед плазмидной ДНК, кодирующей гены VEGF164 и FGF2 (A) и 20 (B) , 40 (C) , 90 (D) , 180 (E) , 360 (F) дня после введения лошади №2 - SLB-десмопатия.

РИСУНОК 6. Эффекты плазмидной ДНК, кодирующей гены VEGF164 и FGF2, у лошадей с поражениями SDFT. (A) % от общей площади поперечного сечения поражения, (B) балла эхогенности, (C) балла выравнивания волокон и (D) площади поперечного сечения ветви поддерживающей связки при максимальном повреждении зона. ^* указывает точку, в которой было достигнуто p <0,05 по сравнению с днем ​​0.

РИСУНОК 7. Ультразвуковые изображения перед плазмидной ДНК, кодирующей гены VEGF164 и FGF2 (A) и 20 (B) , 40 (C) , 60 (D) , 120 (E) , 180 (F) , 240 (G) и 300 (H) через дня после введения лошади № 6 - тендинит SDFT. Стрелка указывает на поражение.

РИСУНОК 8. Поперечные и продольные цветные допплеровские ультразвуковые проекции перед плазмидной ДНК, кодирующей гены VEGF164 и FGF2 (A) и 20 (B) , 40 (C) , 90 (D) , 180 (E) , 360 (F) дня после введения лошади № 3 - десмопатия SLB.

Оценка лошадей с тендинитом SDFT

Лошади с тендинитом SDFT имели поражения сердцевины (две конечности), краевые поражения (четыре конечности) и диффузные поражения (шесть конечностей) (таблица 2).У лошади № 8 с острыми поражениями SDFT в зоне 3c, легкое повреждение кольцевой связки и скопление синовиальной жидкости в оболочке сухожилия также были обнаружены в той же ноге. Во всех случаях контралатеральная конечность не имела значительных отклонений на УЗИ. Только лошади № 5 имели ультразвуковые признаки рубцевания SDFT на противоположной не хромой конечности на 0 день. До лечения боль в сухожилиях из-за надавливания пальцами была отмечена у шести из семи лошадей, только лошадь № 7 с поражением сердцевины. SDFT не показала боли до лечения.Через двадцать дней после лечения у шести из семи лошадей при надавливании пальцами на уровне травмы боли не было. (лошади №4, №5, №7, №8, №9 и №10). К 40 дню после обработки ни у одного из зарегистрированных животных не было признаков воспаления ладонной пястной / подошвенной плюсневой кости в области поражения, не было изменений температуры поверхности кожи, отека или болезненной чувствительности при пальпации.

Пять лошадей вернулись к уровню до травмы и спортивной активности в течение 2–6 месяцев после лечения и реабилитации и не показали хромоты (лошади № 4, № 5, № 7, № 9 и № 10).Две из этих лошадей (№4 и №10) участвовали в соревнованиях по выездке с момента реабилитации до настоящего времени (на момент подачи рукописи). Одна лошадь (№8) была признана здоровой после реабилитации и вернулась к спортивной деятельности, но на более низком уровне. Лошадь № 5 со средней острой тендинопатией SDFT вернулась к своему уровню работоспособности до травмы, но примерно через 6 месяцев после лечения, после возобновления соревновательных прыжков, у этого животного внезапно появилась хромота, которая была связана с повторным повреждением сухожилия. в обработанной конечности.Последняя лошадь (Лошадь № 9, SDFT) получила несвязанную травму контралатеральной конечности примерно через 11 месяцев после лечения (десмит проксимальной поддерживающей связки), что препятствовало анализу результата, но до этого момента спортивные занятия были возобновлены.

Лошади наблюдались на предмет побочных реакций с 0 дня до конца 12-месячного исследования. Не было никаких побочных реакций ни у одной из 7 лошадей, пораженных SDFT, в результате применения пДНК. До лечения, в день 0, средняя степень хромоты составляла 1.86 ± 0,69 у исследуемых лошадей (рис. 1В). В частности, у лошадей №6 перед лечением наблюдалась высокая степень хромоты (Таблица 2). По сравнению с 0-м днем ​​хромота значительно уменьшилась к 20-му дню после лечения до 0,43 ± 0,53 ( p <0,05; Рисунок 1B). Хромота была устранена быстрее у лошадей с тендинитом SDFT, чем у лошадей с десмитом SLB ( P > 0,05). Через 12 недель и постоянно при последующих контрольных осмотрах при клиническом осмотре у 6 из 7 обработанных лошадей хромота не была очевидна (лошадь № 5 была поражена на 180 и 240 дни после выздоровления на 90 и 120 дни).Владельцев попросили оценить производительность лошадей через 12 месяцев после генной терапии. Шесть из семи владельцев оценили спортивный успех как хороший или отличный. Владельцы лошади № 5 (лошадь с началом хромоты после процесса заживления) не могли сообщить о хороших-отличных спортивных успехах на тот момент. Возраст, пол лошадей и продолжительность хромоты не оказали никакого влияния на клинический результат после генной терапии. Основные различия в клинических исходах наблюдались в зависимости от степени и локализации повреждения Т / Л до лечения.

В Таблице 5 и Фигуре 6 показаны результаты УЗИ семи лошадей с тендинитом SDFT до и после лечения плазмидной ДНК, кодирующей гены VEGF164 и FGF2 (см. Также Фигуру 7 и Дополнительную Фигуру S2, репрезентативные изображения лошади №6). Средний общий процент SDFT по шкале CSA, вовлеченных в травму, до лечения составлял 17,44% (диапазон 12,03–23,38%; Таблица 5). У двух пациентов (лошади №7 и №10) основное поражение в SDFT представляло собой смешанную очаговую, дисгомогенную, гипоэхогенную область.У других лошадей с острым тендинитом SDFT до лечения были обнаружены краевые (три конечности) и диффузные поражения (две конечности) с потерей нормального фибриллярного рисунка (таблица 5). Повреждение SDFT было в первую очередь замечено на передних конечностях (Таблица 5). Зона максимального повреждения большинства поражений SDFT располагалась в зонах 1 и 2 (таблица 5). Лошадь № 8 до лечения поступила с острыми поражениями SDFT в зоне 3c, в дополнение к легкому повреждению и утолщению кольцевой связки и скоплению синовиальной жидкости в оболочке сухожилия путового сустава.Во всех случаях тендинита SDFT контралатеральная конечность не имела значимых отклонений. Лошадь № 9 перед лечением показала ультразвуковые признаки рубцевания SDFT на контралатеральной не хромой конечности (день 0). ППС пораженной SDFT-конечности во время лечения была больше, чем ППС противоположной нормальной конечности, что соответствует травме. Среднее значение T-CSA SDFT до лечения составляло 972,9 мм ² (диапазон 867–1272 мм ² ) (Таблица 5).

ТАБЛИЦА 5. Результаты УЗИ лошади с тендинитом SDFT до и после лечения плазмидной ДНК, кодирующей гены VEGF164 и FGF2.

Ультразвуковые характеристики поражений SDFT у большинства лошадей начали улучшаться через 20 дней после лечения. Эта положительная тенденция перестройки в процессе заживления SDFT постоянно сохранялась в последующие дни наблюдения. Когда лошади начали свою программу упражнений, архитектура сухожилий восстановилась еще лучше, о чем свидетельствует их продольное расположение и длина.На 20 день после лечения было замечено, что T-CSA-L в%, T-ES, T-FAS и T-CSA (рисунки 6A – D, соответственно) были лучше у всех пациентов с SDFT, с заметным тканевое заполнение очагов поражения, но степень и скорость изменения этих ультразвуковых параметров в дальнейшем с течением времени менялись по-разному (таблица 5). Например, в течение 12-месячного периода наблюдений было замечено уменьшение размера T-CSA (в мм ² ), но изменения не были значительными (Рисунок 6D).По сравнению с контралатеральной конечностью SDFT, T-CSA не был значительно выше в течение всего периода наблюдения. T-CSA-L% (таблица 5 и фиг. 6A) лошадей с SDFT-поражениями снизился на 40 день после лечения у всех лошадей, за исключением одной лошади (лошадь № 9), которая показала более высокий% CSA-L. Общее среднее значение CSA-L в% показало непрерывное снижение с течением времени, которое было значительным ( p <0,05) впервые на 60-й день по сравнению с 0-м днем ​​(Рисунок 6A). Постоянное снижение общего процента поперечного поражения SDFT было зарегистрировано при последующих наблюдениях через 90, 120, 240, 300 и 360 дней.Только на 180-й день наблюдалось умеренное увеличение процента поражения T-CSA, однако у лошади №5 в этот момент был рецидив повреждения.

Оценка эхогенности поражения SDFT (T-ES) после лечения непрерывно и значительно снижалась с 0 по 60 день у всех лошадей, за исключением лошади 8, которая показала увеличение T-ES между 40 и 60 днями. Эхогенность оценка значительно снизилась ( p <0,05) к 20-му дню (рис. 6B). Наконец, через 3 месяца после лечения эхо-текстура у большинства лошадей была более регулярной, а волокна коллагена были ориентированы в большей степени параллельно продольной оси.

Показатели линейного рисунка волокон (T-FAS) улучшались в ходе исследования у лошадей с поражением SDFT, но медленно по сравнению с показателем эхогенности (рис. 6C). T-FAS был значительно ( p <0,05) впервые снизился на 60-й день. Постоянное снижение общих баллов для линейных рисунков волокон и показателей эхогенности было замечено в более поздние контрольные дни исследования, но на 180-й день легкое снижение. наблюдалось увеличение этих ультразвуковых параметров. Это произошло одновременно с повторным повреждением, наблюдаемым у лошади №5.Через 9 месяцев признаки поражения сухожилий можно было с трудом обнаружить у большинства лошадей с травмой SDFT, поскольку они показали заметно правильное выравнивание и хорошо организованный продольный рисунок.

Оценка T / L поражений с использованием CDU показала, что у большинства лошадей с тендинопатией SDFT до лечения присутствовали только небольшие цветные очаги, которые ритмично мигали в области поражения. Средний балл цветного допплера для васкуляризации максимальной исследуемой зоны для SDFT и SLB до лечения составлял 1.13 (± 0,30), немного выше по сравнению со здоровыми контралатеральными конечностями (0,8 ± 0,52). Показатели цветового допплера для васкуляризации максимальной зоны исследования для SDFT и SLB после обработки плазмидной ДНК, кодирующей гены VEGF164 и FGF2, показали заметное увеличение показателей уже к 20-му дню (2,37 ± 0,60; Таблица 4 и Рисунки 4B, 8). Эта тенденция длилась до 90–120 дней, при этом максимальный балл был достигнут на 40 день (2,83 ± 0,35). Показатели CDU у большинства животных затем постепенно снижались до базальных показателей (как у здоровых конечностей) через 180 дней лечения, что указывает на характер кровотока, аналогичный дню 0 (рис. 4).Не наблюдалось значительной корреляции между тяжестью поражений T / L до лечения и баллами CDU после лечения. После лечения не было значительных различий в показателях CDU между лошадьми SDFT и SLB, поэтому изменения в показателях CDU были строго индивидуальными.

Обсуждение

Заживление сухожилий или связок - длительный процесс, который зависит от серьезности и размера поражения. Различные методы лечения поражений T / L были описаны ранее; однако частота рецидивов травм высока даже после длительных периодов восстановления, и ни один из этих методов лечения не приводит к полной регенерации тканей.Ранее мы впервые продемонстрировали, что прямая генная терапия с использованием инъекции плазмидной ДНК, кодирующей видоспецифичные кДНК VEGF164 и FGF2, приводит к быстрому восстановлению (2–3 недели) поддерживающей ветви связки и повреждений SDFT у двух лошадей (Kovac et al., 2017 ). В текущем продолжении и расширении предыдущего исследования мы лечили 10 случаев, чтобы восстановить естественные умеренные и тяжелые травмы SDFT и ветвей поддерживающей связки, с помощью более быстрой программы упражнений, чем традиционно применяется при поражениях T / L у лошадей. (Годвин и др., 2012). Согласно нашим клиническим наблюдениям, прямая генная терапия у 9 из 10 лошадей привела к более раннему снижению степени хромоты. Время реабилитации также было значительно сокращено до 20 недель, что составляет всего 50% от обычного периода восстановления после травм сухожилий / связок лошадей (Reef, 2001). Через 2–6 месяцев после завершения лечения 9 лошадей продемонстрировали успешное возвращение к уровню спортивной нагрузки до травмы, в наших случаях это было использование лошадей в выездке или прогулке / верховой езде.Важно подчеркнуть, что традиционно абсолютной регенерации тканей не следует ожидать, даже если хромота уменьшилась после лечения тендинита лошадей. В нашем исследовании мы наблюдали быструю регенерацию как SDFT, так и поддерживающей связки у большинства лошадей в течение 2–6 месяцев лечения путем измерения общей площади поперечного сечения, процента площади поперечного сечения поражения, показателя эхогенности и процент параллельных коллагеновых волокон. Ультрасонографические характеристики поражений T / L начали заметно улучшаться через 3 недели.Эта тенденция постоянно сохранялась в последующих исследованиях. Интенсивные тренировки лошади могут быть интегрированы в режим после того, как ультразвуковые исследования подтвердят почти полное заживление травмированной Т / Л. Когда лошади в нашем испытании начали программу упражнений, архитектура сухожилий еще больше улучшилась, что было продемонстрировано их продольным расположением и длиной. Частично эти эффекты можно объяснить совпадением с условиями и фазами нормального T / L заживления. Тем не менее, наши данные отражают случаи средних и тяжелых поражений T / L, и такие значения обычно связаны с плохим прогнозом.

Системных побочных реакций в результате применения плазмидной ДНК, кодирующей видоспецифичные кДНК VEGF164 и FGF2, не наблюдалось. Лошадь, которая не реагировала на лечение, оставалась хромой в течение первых 3 месяцев после лечения, у нее были серьезные повреждения ветви и тела SL. Только одна здоровая лошадь после реабилитации (изначально страдающая тендинитом SDFT) получила повторную травму через 6 месяцев после лечения. Через двенадцать месяцев после лечения 8 из 10 владельцев лошадей оценили результативность своих лошадей после генной терапии с точки зрения спортивного успеха как хороший или отличный.По нашим наблюдениям, возраст и пол лошадей, а также продолжительность хромоты до лечения не оказали никакого влияния на клинический результат после генной терапии. Основным фактором, влияющим на клинический исход, была степень и локализация повреждения Т / Л до лечения. Данные, полученные в этом клиническом исследовании, обнадеживают и показывают, что на ранних стадиях заживления травм как тендинита, так и десмитиса у лошадей могут быть заметные положительные изменения, если области дефекта обработать непосредственно плазмидной ДНК, кодирующей видоспецифичные кДНК VEGF164 и FGF2.Частично эти эффекты можно объяснить совпадением с условиями и фазами нормального заживления сухожилий. Тем не менее, наши данные отражают только случаи умеренного или тяжелого поражения сухожилий; такие значения, как хорошо известно, связаны с плохим прогнозом при применении стандартных методов лечения.

Ограничением настоящего клинического исследования было то, что исследование не определило точный механизм действия прямой генной терапии с pBUDK-ecVEGF164-ecFGF2 на заживление поврежденных сухожилий и связок лошадей.Из-за отсутствия предыдущих отчетов о результатах лечения тендинита и десмитиса лошадей таким способом мы не можем сравнивать наши результаты с результатами других методов лечения. На основании некоторых предыдущих исследований факторы роста VEGF и FGF2 представляют собой белки, которые в основном высвобождаются тромбоцитами, фибробластами и эндотелиальными клетками в месте повреждения (Byrne et al., 2005). Их механизмы действия сложны и тесно связаны с другими факторами воспаления и регенерации. Считается, что они стимулируют миграцию тендобластов, фибробластов и мезенхимальных стволовых клеток, которые отвечают за выработку коллагена и других компонентов внеклеточных компонентов связок и сухожилий, таких как протеогликаны, гликозаминогликаны и гликопротеины, посредством усиленного ангиогенеза (процесса образования новых кровеносных сосудов). ) в месте травмы (Martinek et al., 2005).

В нашем исследовании наблюдалось увеличение количества и интенсивности сигналов сосудов в области поражения T / L после лечения, обнаруженное CDU. Оценка поражений с использованием CDU показала у большинства лошадей до лечения только небольшие цветные очаги, которые ритмично мигали в области поражения. Показатели цветного допплера для васкуляризации максимальной исследуемой зоны показали заметное увеличение показателей уже к 20-му дню после лечения. Это увеличение продолжалось до 90–120 дней с максимумом на 40 день.Изменения показателей CDU после лечения были строго индивидуальными. Показатели CDU у большинства лошадей, изучаемых нами, затем постепенно снижаются до базальных показателей после 180 дней лечения. Эти изменения в показателях CDU можно объяснить тем фактом, что нормальный T / L является гиповаскулярным, а ангиогенез или повышенная васкуляризация связаны с острым повреждением, наблюдаемым в пролиферативной, но не в фазе ремоделирования при заживлении сухожилия (Carvalho et al. , 2013), т. Е. Гиперваскуляризация является нормальным явлением в процессе заживления.Согласно нашим наблюдениям, не было значительной корреляции между тяжестью поражений T / L до лечения и баллами CDU после лечения. Другими словами, положительные сигналы кровотока могут быть следствием временного увеличения кровотока в собственных сосудах в ответ на гипоксию ткани сухожилия, связанную с травмой. По данным Hatazoe et al. (2015), полуколичественное определение кровотока в сухожилиях лошади может предложить новый метод дифференциации активного и неактивного воспаления в сухожилии, связанного с травмами, а также для определения динамики травмированных связок сухожилий.Мы предполагаем, что этот эффект ангиогенеза заметно усиливается после генной терапии VEGF164 и FGF2.

Мы предположили, что перенос генов FGF2 и VEGF164 в T / L лошадей повысит выработку факторов роста и коллагенов, что значительно повысит силу заживления в критический период заживления сухожилий. Ген FGF2 был выбран по ряду причин. Во-первых, FGF является одним из основных факторов роста для восстановления тканей, и его основное действие заключается в стимулировании выработки коллагена, развитии сухожилий, пролиферации теноцитов, а также он играет роль в стимулировании экспрессии ряда других генов факторов роста ( Tang et al., 2016). Кроме того, FGF подавляется во время восстановления сухожилий при нормальных обстоятельствах, и низкие уровни FGF могут быть основной причиной плохого потенциала заживления сухожилий (Tang et al., 2014). Ген фактора роста эндотелиальных клеток сосудов (VEGF) был выбран по ряду причин. Этот фактор роста является одним из наиболее важных ангиогенных факторов при заживлении сухожилий, но при нормальных обстоятельствах в сухожилиях наблюдается низкий уровень экспрессии VEGF (Berglund et al., 2011). VEGF также усиливает выработку коллагена через сигнальные пути киназы MAP и увеличивает проницаемость сосудов за счет синтеза фактора активации эндотелиальных тромбоцитов (Brkovic and Sirois, 2007).В комбинации FGF и VEGF увеличивают пролиферацию и предотвращают апоптоз фибробластов сухожилий и эффективно корректируют недостаточность способности заживления сухожилий (Tang et al., 2016). Также было высказано предположение, что активация FGF может представлять собой ранний устойчивый сигнал для ангиогенеза (Stavri et al., 1995).

Генная терапия, как одна из самых передовых технологий в медицине, является многообещающим методом лечения наследственных заболеваний и, кроме того, предлагает новые возможности для клинического лечения множества ортопедических заболеваний, включая травмы сухожилий и связок (Evans et al., 2009; Bosch et al., 2011; Tang et al., 2016). Использование прямой генной терапии этими специфическими факторами роста также весьма перспективно для лечения ортопедических заболеваний не только у лошадей, но и у других видов животных и человека (Ризванов и др., 2018). Ранее сообщалось об успешном применении прямой генной терапии с аналогичной плазмидной конструкцией на основе собачьих генов VEGF164 и костного морфогенетического белка (BMP2) для лечения повреждения передней крестообразной связки у собак крупных пород (Закирова и др. ., 2014). Более того, в отчете о клиническом случае человека генная терапия пДНК, кодирующая гены VEGF и FGF2, использовалась для лечения пациентов с критической ишемией нижних конечностей (Plotnikov et al., 2012). Наконец, плазмидная ДНК pl-VEGF165 (официально зарегистрированная как Neovasculgen), кодирующая человеческий VEGF165, продемонстрировала безопасность и эффективность у пациентов с хронической ишемией нижних конечностей при лечении атеросклеротического заболевания периферических артерий без побочных эффектов (Deev et al., 2015, 2017) . Во всех этих случаях была продемонстрирована высокая эффективность и безопасность прямой генной терапии пДНК.Следует отметить, что в литературе широко используются и другие методы. Был использован ряд векторов (включая плазмиду, лентивирус, аденовирус, аденоассоциированный вирус и другие модифицированные вирусные платформы) и систем доставки (включая липофекцию, катионные наночастицы, полимеры, дендримеры) (Dunbar et al., 2018; Rizvanov et al. ., 2018). Наш подход с использованием голой плазмидной ДНК считался подходящим как самый безопасный способ проведения генной терапии, поскольку другие подходы могут иметь более высокую токсичность, иммуногенность и даже онкогенный потенциал (в случае интеграции вирусных векторов).Для достижения высокой эффективности с голой пДНК было выполнено несколько точек инъекции (на расстоянии 0,5–1 см друг от друга) как в поврежденную, так и в прилегающую нормальную ткань, чтобы обеспечить более полную инфильтрацию ткани. Будущие испытания будут включать использование систем доставки для обеспечения оптимальной эффективности.

Уровень фактора роста эндотелиальных клеток сосудов достигает пика после воспалительных реакций, и это особенно заметно во время фаз пролиферации и ремоделирования.Генная терапия FGF2 и VEGF in vitro, и in vivo с аденоассоциированными вирусными векторами в сухожилиях сгибателей птиц выявила повышенный уровень коллагена I типа плюс другие внеклеточные молекулы, ускоренную клеточную пролиферацию и улучшение прочности и эластичности сухожилий (Tang et al., 2016).

Клинические и ультразвуковые данные, полученные в этом исследовании, обнадеживают, но они основаны на относительно небольшом количестве лошадей, направленных с различной степенью и локализацией поражений T / L.Несмотря на количество клинических случаев, этот метод использования прямой генной терапии для лечения травм T / L у лошадей является уникальным и многообещающим, однако требует дальнейших исследований. Для дальнейшей оценки прямого воздействия генной терапии VEGF и FGF2 на заживление поврежденных сухожилий и связок у лошадей проводится оценка большого количества экспериментальных животных с увеличенным сроком наблюдения и рандомизированными контролируемыми клиническими испытаниями или двойным слепым исследованием. требуется. Более полный и подробный механистический подход также может быть получен путем получения гистологических образцов и проведения иммуногистохимии материалов биопсии.Такие факторы, как уровни экспрессии генов в тканях, анализ, идентификация и количественная оценка коллагенов, функциональное и внутриклеточное распределение белков и дальнейшие исследования биохимии патологического процесса - все это поможет установить лежащие в основе механизмы действия. Внедрение генной терапии в клиники ветеринарной медицины становится все более актуальной, однако существует ряд проблем, которые необходимо решить. Это исследование делает значительные успехи в использовании генной терапии и механизмов, лежащих в основе процесса заживления.

Авторские взносы

МК медицинская диагностика, клиническое наблюдение за лошадьми, введение пДНК, дизайн исследования (клиническая часть) и написание рукописи. Очистка YL пДНК клинического уровня для генной терапии, помощь в введении пДНК, дизайн исследования, сбор данных и интерпретация результатов, а также написание рукописи. Сбор и интерпретация клинических данных РА. EZ-тестирование эффективности пДНК и редактирование рукописи. Интеллектуальный вклад CR и AK, анализ результатов и написание рукописи.AR-дизайн исследования, интерпретация результатов и интеллектуальный вклад в обсуждение и написание рукописи.

Финансирование

Работа поддержана Программой повышения конкурентоспособности Казанского федерального университета и субсидией, выделенной Казанскому федеральному университету для государственного задания в сфере научной деятельности 20.5175.2017 / 6.7. Некоторые эксперименты проводились на оборудовании Междисциплинарного центра коллективного пользования и Фармацевтического научно-образовательного центра Казанского (Приволжского) федерального университета, г. Казань, Россия.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2018.00978/full#supplementary-material

РИСУНОК S1 | Проекты ультразвукового исследования до плазмиды, кодирующей гены VEGF164 и FGF2, у лошадей, пораженных SLB.До лечения (A, B) и после выздоровления (C, D) . Лошадь № 1 (A, C) и № 3 (B, D) .

РИСУНОК S2 | Ультразвуковые изображения до и после плазмиды, кодирующей гены VEGF164 и FGF2 у лошадей, пораженных SDFT. До лечения (A – E) и после выздоровления (F – J) . Лошадь № 4 (A, F) , № 5 (B, G) , № 7 (C, H) , № 8 (D, I) и № 10 (E, J) .

Сокращения

AAEP, Американская ассоциация коневодов; CDU, цветная допплерография; CSA, площадь поперечного сечения; EMA, Европейское агентство по лекарственным средствам; FDA, управление продуктами питания и лекарствами; FGF2, фактор роста фибробластов 2; LF, левая передняя конечность; LH, левая задняя конечность; МИЗ - зона максимального повреждения; MIZ-CSA - максимальная площадь поперечного сечения зоны повреждения; MIZ-ES - оценка максимальной эхогенности очага поражения; MIZ-FAS - максимальная оценка выравнивания волокон в зоне повреждения; MIZ-lesion%, максимальный процент поражения зоны повреждения; РФ, правая передняя конечность; Правая задняя конечность; SDFT, сухожилия поверхностного сгибателя пальцев; SLB, ветви поддерживающей связки; Т / Л, сухожилия / связки; T-CSA - общая площадь поперечного сечения сухожилия; T-CSA-L%, общий процент площади поперечного сечения поражения; T-ES - общий балл эхогенности поражения; T-FAS - общий балл за выравнивание волокна; VEGF164, фактор роста эндотелия сосудов.

Список литературы

Берглунд, М. Э., Харт, Д. А., Рино, К., и Уиг, М. (2011). Фактор роста и экспрессия протеазы во время различных фаз заживления после восстановления сухожилия глубокого сгибателя кролика. J. Orthop. Res. 29, 886–892. DOI: 10.1002 / jor.21330

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бест, Т. М., Гараибех, Б., и Хуард, Дж. (2013). Стволовые клетки, ангиогенез и заживление мышц: потенциальная роль в массажной терапии? Br.J. Sports Med. 47, 556–560. DOI: 10.1136 / bjsports-2012-091685

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бош, Г., Молеман, М., Барневельд, А., Ван Верен, П. Р., и Ван Ши, Х. Т. (2011). Влияние богатой тромбоцитами плазмы на неоваскуляризацию хирургически созданных поражений сухожилий поверхностных сгибателей пальцев рук лошади. Сканд. J. Med. Sci. Спорт 21, 554–561. DOI: 10.1111 / j.1600-0838.2009.01070.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бркович, А.и Сируа М.Г. (2007). Проницаемость сосудов, индуцированная членами семейства VEGF in vivo: роль эндогенного PAF и синтеза NO. J. Cell. Biochem. 100, 727–737. DOI: 10.1002 / jcb.21124

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бирн, А. М., Бушье-Хейс, Д. Дж., И Харми, Дж. Х. (2005). Ангиогенные функции и функции выживаемости клеток фактора роста эндотелия сосудов (VEGF). J. Cell Mol. Med. 9, 777–794. DOI: 10.1111 / j.1582-4934.2005.tb00379.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Карвалью А. Д., Бадиал П. Р., Альварес Л. Э., Ямада А. Л., Борхес А. С., Деффуне Э. и др. (2013). Терапия тендинита лошадей с использованием мезенхимальных стволовых клеток и концентратов тромбоцитов: рандомизированное контролируемое исследование. Stem Cell Res. Ther. 4:85. DOI: 10.1186 / scrt236

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Деев Р., Плакса И., Бозо И., Исаев А. (2017). Результаты международного постмаркетингового исследования безопасности и эффективности pl-VEGF165 у 210 пациентов с заболеванием периферических артерий. Am. J. Cardiovasc. Наркотики 17, 235–242. DOI: 10.1007 / s40256-016-0210-3

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Деев Р.В., Бозо И.Ю., Мжаванадзе Н.Д., Воронов Д.А., Гавриленко А.В., Червяков Ю.В. и др. (2015). Внутримышечный перенос гена pCMV-vegf165 является эффективным методом лечения пациентов с хронической ишемией нижних конечностей. J. Cardiovasc. Pharmacol. Ther. 20, 473–482. DOI: 10.1177 / 1074248415574336

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Данбар, К.Э., Хай, К. А., Джунг, Дж. К., Кон, Д. Б., Одзава, К., и Саделайн, М. (2018). Генная терапия достигает совершеннолетия. Наука 359: eaan4672. DOI: 10.1126 / science.aan4672

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дайсон, С. Дж. (2004). Медицинское лечение тендинита поверхностных сгибателей пальцев: сравнительное исследование на 219 лошадях (1992-2000 гг.). Equine Vet. J. 36, 415–419. DOI: 10.2746 / 0425164044868422

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

EMA (2001). Документ для размышлений о модификациях конструкции лекарственных препаратов для генной терапии в процессе разработки. Лондон: Европейское агентство по лекарственным средствам.

EMA (2006 г.). Руководство по доклиническим исследованиям, необходимым перед первым клиническим применением лекарственных препаратов для генной терапии. Лондон: Европейское агентство по лекарственным средствам.

EMA (2007). Руководство по наблюдению за пациентами, которым вводили лекарственные препараты для генной терапии. Лондон: Европейское агентство по лекарственным средствам.

Google Scholar

FDA (2007). Соображения относительно вакцин плазмидной ДНК по показаниям от инфекционных заболеваний. Мэриленд: Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов.

Google Scholar

FDA (2008). Содержание и обзор информации о химии, производстве и контроле (CMC) для новых исследовательских приложений (IND) для терапии соматических клеток человека. Мэриленд: Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов.

Google Scholar

Гиллис, К. Л. (1997). «Реабилитация травм сухожилий и связок», в протоколе Proceedings of the Annual Convention of the AAEP , (Дэвис, Калифорния: Калифорнийский университет), 306–309.

Google Scholar

Годвин, Э. Э., Янг, Н. Дж., Дудхия, Дж., Бимиш, И. К., и Смит, Р. К. (2012). Имплантация мезенхимальных стволовых клеток костного мозга демонстрирует улучшение результатов у лошадей с повреждением сухожилия поверхностного сгибателя пальца. Equine Vet. J. 44, 25–32. DOI: 10.1111 / j.2042-3306.2011.00363.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хатазоэ, Т., Эндо, Ю., Ивамото, Ю., Коросуэ, К., Курода, Т., Иноуэ, С., и др. (2015). Изучение распределения цветных доплеровских потоков в сухожилиях поверхностного сгибателя пальцев молодых чистокровных лошадей во время тренировочных периодов. J. Equine Sci. 26, 99–104. DOI: 10.1294 / jes.26.99

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

ICVGAN. (2017). «Nomina Anatomica Veterinaria», в Труды Международного комитета по общей ветеринарной анатомической номенклатуре и Всемирной ассоциации ветеринарных анатомов , 6-е изд.(Осло: Норвежский университет естественных наук).

Джунджа, С. К., Шварц, Э. М., О’Киф, Р. Дж., И Авад, Х. А. (2013). Клеточные и молекулярные факторы восстановления сухожилий сгибателей и спаек: гистологический анализ и анализ экспрессии генов. Connect. Tissue Res. 54, 218–226. DOI: 10.3109 / 03008207.2013.787418

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ковач М., Алиев Р., Ставицкий С., Еремин П. С., Пулин А. А., Еремин И. И. (2016).Мезенхимальные стволовые клетки в терапии поражений сухожилий и связок у лошадей. Vetpharma 12, 72–76.

Ковач М., Литвин Ю.А., Алиев Р.О., Закирова Э.Ю., Ратленд К.С., Киясов А.П. и др. (2017). Генная терапия с использованием плазмидной ДНК, кодирующей гены фактора роста сосудистого эндотелия 164 и фактора роста фибробластов 2, для лечения тендинита и десмитиса лошади: отчеты о случаях. Фронт. Вет. Sci. 4: 168. DOI: 10.3389 / fvets.2017.00168

Жизненный цикл и фазы пчел

• Звоните:
• Локации Введите ваш почтовый индекс

  Введите ваш почтовый индекс Идти

• Служба поддержки клиентов
• Моя учетная запись

Для вашего дома Для вашего бизнеса

• Борьба с вредителями
• Termite Control
• Клопы
• Все услуги

  ПЕСТ-УСЛУГИ

  • Борьба с вредителями
  • • Постельные клопы
    • Мотыльки
    • Сверчки
    • Блохи
    • Шершни
    • Скорпионы
    • Серебрянка
    • Плотник Муравьи
    • Тараканы
    • Мыши
    • Пауки
    • Сороконожки
    • уховертки
    • клещей
  • Контроль термитов
  • • Лечение
    • Приманка и мониторинг
  • Лечение муравья-плотника
  • Постельный клоп
  • Лечение блох
  • Борьба с комарами
  • Лечение жалящих вредителей
  • Лечение клещей

  ДОМАШНИЕ УСЛУГИ

  • Утепление чердака
  • Уход за газоном
  • Контроль влажности
• Библиотека вредителей

  ПОПУЛЯРНЫЕ ВРЕДИТЕЛИ

  • Муравьи
  • Постельные клопы
  • Тараканы
  • Летит
  • Комаров
  • Грызунов
  • Жалящие вредители
  • Термиты
  • Другие вредители
  • Bug Bite Фотогалерея
  • Начни с науки
  • Посетите библиотеку вредителей

  • СПРОСИТЕ ОРКИНА

    Учить больше
• Почему Оркин?

Поиск текста Поиск

Поиск Получите свою оценку 844-503-8251

• Локации
• Поиск

Введите ваш почтовый индекс

Введите ваш почтовый индекс Идти

Что вы ищете?

Текст поиска Идти

• Для вашего дома Для вашего бизнеса
• Борьба с вредителями
• Контроль термитов
• Постельные клопы
• Все услуги

  ПЕСТ-УСЛУГИ

  • Борьба с вредителями
  • Контроль термитов
  • Постельный клоп
  • Лечение муравья-плотника
  • Лечение блох
  • Борьба с комарами
  • Лечение жалящих вредителей
  • Лечение клещей

  ДОМАШНИЕ УСЛУГИ

  • Утепление чердака
  • Дезинфицирующая чистка
  • Уход за газоном
  • Контроль влажности
• Библиотека вредителей
  • Посетите библиотеку Pest >>

  ПОПУЛЯРНЫЕ ВРЕДИТЕЛИ

  • Муравьи
  • Постельные клопы
  • Тараканы
  • Летит
  • Комаров
  • Грызунов
  • Жалящие вредители
  • Термиты
  • Другие вредители
  • Bug Bite Фотогалерея
  • Начни с науки
  • Спросите Оркина
• Получите свою оценку
• Почему Оркин?
• Обслуживание клиентов
• Мой аккаунт

• Для вашего дома Для вашего бизнеса
• Отрасли
  • Назад
  • Производство продуктов питания и напитков
  • Общественное питание
  • Правительство
  • Здравоохранение
  • Гостеприимство
  • Логистика
  • Многосемейная
  • Управление недвижимостью офиса
  • Фармацевтическая
  • Розничная торговля
  • Образование
  • Другие отрасли
• Сервисы
  • Назад

  ПЕСТ-УСЛУГИ

  • Комплексная борьба с вредителями
  • Постельный клоп Proact для гостеприимства
  • Постельные клопы
  • Борьба с грызунами
  • Борьба с птицами
  • Контроль полета
  • Борьба с комарами
  • Контроль термитов

  ДРУГИЕ УСЛУГИ

  • Дезинфицирующая чистка
  • Услуги исключения
  • Чистка полов и канализации
  • Уход за туалетом
  • Национальные счета
  • Контроль запаха
  • Сервисная документация
  • Обучение сотрудников

.