Перейти к содержимому

Какие клетки нужны для крыс: Как выбрать клетку для крысы?

Содержание

Как выбрать клетку для крысы?

Опубликовано: 3 ноября 2016 года Просмотров: 21106

Клетка для грызуна – это настоящий большой мир, который при правильном подходе максимально приближен к естественным условиям обитания. Да, клетка в любом случае ограничивает пространство, но если модель подобрана правильно, питомец в своем жилище чувствует себя совершенно комфортно. Немаловажным моментом является и безопасность. Свободное передвижение крысы по квартире может закончиться для нее серьезными травмами, т.к. человеческое жилище изобилует потенциально опасными для зверька факторами. Словом, клетка для крысы – это предмет первой необходимости. Однако выбрать подходящую клетку не так легко, как кажется на первый взгляд. Перечислим основные критерии, которые обязательно должны учитываться при покупке. 

  • Подбираем клетку с учетом характеристик и потребностей вида грызуна. К примеру, крысе ни в коем случае не подойдет миниатюрная клеточка для хомяка (и тем более аквариум для рыбок).

  • Клетка должна быть просторной! Крысы – очень активные зверьки, они обожают бегать, прыгать, играть и выполнять разные трюки. Однако свободное пространство необходимо им не только для интересного досуга, но и для правильно развития. В тесной клетке крысы находятся в состоянии стресса и часто болеют.

Таких активных грызунов, как крысы, нельзя постоянно держать в клетке. Время от времени выпускайте зверьков побегать по комнате, но строго контролируйте их передвижение. Следите, чтобы безопасности питомцев ничто не угрожало. К примеру, крыса практически со 100% вероятностью решит попробовать на вкус провода. Наша задача – не допустить потенциально опасных для зверька ситуаций.

  • Крысам идеально подходят просторные 2- и 3-этажные клетки, т.к. зверьки могут в них свободно перемещаться. Кроме того, многоуровневые конструкции позволяют размещать в клетке разнообразные игрушки, препятствия и другие аксессуары, призванные сделать жизнь вашего питомца еще более счастливой!


  • Лучше всего выбирать металлические клетки с пластиковым поддоном. Металл прослужит долго и качественно, а пластиковый поддон значительно облегчит уборку клетки. Не забывайте, что такие зверьки, как мыши и крысы, любят помусорить, а потому лучше не пренебрегать этим пунктом.

  • Для поддержания чистоты на дно клетки помещается специальный наполнитель для грызунов. Заменять его нужно не реже 1 раза в неделю.

  • Избегайте деревянных клеток (крысы будут грызть дерево, к тому же этот материал впитывает жидкости и легко загрязняется) и аквариумов (в них нарушается газообмен и держится повышенная влажность).

Не забудьте установить в клетке минеральный камень. Если у крысы не будет предмета для стачивания зубов, она начнет грызть прутья клетки (даже металлические). Что негативно скажется как на состоянии зубов, так и на состоянии шерстки на мордочке.

  • Габариты клетки для одной крысы должны составлять не менее 60×50×60 см.

  • Если у вас несколько крыс, лучшим выбором будет просторная клетка для хорьков или белок. Также вы можете заказать изготовление специального вольера.

Удачной вам покупки!

Выбираем клетку для домашней крысы

Есть такое выражение: «Если нельзя, но очень хочется, то, несомненно, можно!». Вы решили приобрести себе крысу. А что вам известно о ней? Давайте сделаем не большой экскурс в мир этих животных.   Это - грызуны, очень сообразительные, чистоплотные, живущие в группах и общающиеся друг с другом при помощи языка тела и ультразвуковых сигналов. Они сильно привязываются к хозяевам и даже реагируют на своё имя.

Но, как и любому комнатному питомцу, крысе необходимо жилище.

Клетка для крысы должна быть комфортной, просторной, так как крыса в ней проводит всё своё свободное время - 18-20 часов в сутки. Вам известно, что крыса из семейства грызунов, то клетки для них могут быть металлические, проволочные с мелкой решёткой, желательно в несколько этажей и с пластиковым поддоном. Размер клетки: примерно 60х35х60см., но для самочек важно - выше, а для самцов – длиннее. Можно использовать и клетки для попугаев, но обратить внимание на промежутки между прутьями (не больше 1 см.). Хорошо сделать несколько этажей, применив для этого полочки или решётки.

Оборудование клетки. Чтобы зверьку не было тревожно, хорошо в клетке устроить небольшой уютный домик и поместить его в середине клетки или наверху. В домике должна быть подстилка: ткань или мягкая бумага. Для устройства домика, лучше всего подойдёт твёрдый пластик. Он должен быть такого размера, чтобы зверёк мог спокойно стоять, лежать. Лаз в домик свободным. А ещё крыса очень любит гамак, который можно прикрепить в клетке за прутья. В клетке обязательно должны быть глиняные или металлические кормушки для еды (они более устойчивые), поилки, мягкие туннели, угловой туалет. Поилку надо подвесить на другой стороне от домика, чтобы в воду не попадали отходы, которые могут привести к болезням.

Дно клетки  должно быть целостным. На дно клетки можно для подстилки использовать сено, опилки или туалетную бумагу или кукурузные наполнители. Клетку необходимо чистить раз в неделю, но все промокшие предметы надо убирать ежедневно, чтобы не появились источники инфекции.

Комната, где находиться клетка с питомцем, должна быть сухой, светлой, достаточно проветриваемой, с температурой 18-20 градусов и влажностью воздуха 60-70 %. Обратить внимание на отсутствие сквозняков, ставить подальше от отопительных приборов.

Крыс желательно содержать однополыми парами или группами, так как они в одиночестве тоскуют.

Жилье для декоративной крысы - МИВ

06 апр 2016|Экзоты и грызуны

Не  смотря на обилие информации по содержанию  животных, их кормлению и разведению,  регулярно сталкиваюсь с проблемами здоровья грызунов, возникших по вине их владельцев. Хотелось бы заострить  внимание на ряде особенностей в содержании и питании крыс, Ваших компаньонов и домашних питомцев, с точки зрения ветеринарного врача-родентолога. 

     Жилье для крысы

     В клетке или на воле? Содержание в клетке предпочтительнее. Во-первых, крыса не сможет сильно повредить Ваше собственное жилище (она же грызун!). Кроме того, крыса не будет бегать в клетку «по нужде», что приведет Ваше жилище в плачевный вид. Во-вторых, вольное содержание подразумевает глотание пыли под шкафами, поедание отравы от бытовых насекомых и самих этих насекомых, возможное переохлаждение, травмы и прочие неприятности. В-третьих, крыса должна регулярно общаться с людьми, чтобы не одичать. А для  физического здоровья и развлечений крысе достаточно регулярно выгуливаться под Вашим присмотром, например, на диване.

     Какая должна быть клетка? Клетка должна быть достаточно просторной. Чем длительнее предполагается пребывание крысы в клетке, тем больше она должна быть, чтобы обеспечить животному возможность игры и выгула, лазания, перемещения по вертикали. Не плохо бы подвесить гамак, спиральные лесенки-трубы, разделить клетку на этажи, отделения, комнатки. Многим крысам нравится, когда внутри клетки есть еще домик, укромное место, где она спрячет «заначку» или сможет уединиться от Ваших рук и глаз. Наличие такого укромного уголка положительно влияет на психическое здоровье Вашего любимца.

     Мне больше нравятся клетки из проволоки. Они обеспечивают лучшую вентиляцию, чем аквариумы. Кроме того, в этой клетке легче подвесить разные игрушки, по ней легко лазить, она не отгораживает животное от общения с людьми, от разных запахов и звуков. Длинная клетка со многими закоулками гораздо интереснее для крысы, чем многоярусный небоскреб. Очень интересна конструкция из соединенных между собой больших пластиковых бутылей из-под воды. Горлышки от бутылей используются для соединения камер-отделений. Их легко перекрыть завинчивающейся крышкой и помыть отсоединенный блок. Можно устроить многокомнатные апартаменты: спальня, туалет, кладовая и т.д.

     Очень важно, чтобы прутья клетки были покрыты  специальным материалом (винилом) против коррозии и легко мылись. Расстояние между прутьями решетки не должны быть очень большие, так как лапы животного могут провалиться и застрять между ними, причинив тяжкий вред, вплоть до переломов. Ярусы в клетке должны легко сниматься, чтобы разнообразить помещение и не мешать мыть клетку.

     Не  используйте клетки или ящики, сделанные  из дерева. Во-первых, это не гигиенично. Моча впитывается в древесину, ее невозможно отмыть. Накопление аммиака  вызывает раздражение слизистых  оболочек глаз и дыхательных путей. Это может стать причиной болезни грызуна. Кроме того, древесина сосны и кедра выделяет токсические ароматические углеводороды, накапливаясь в организме зверька, они могут привести к интоксикации и поражению внутренних органов. Еще одна опасность деревянных клеток – занозы и травмирование конечностей. Да и надежность деревянной клетки для изоляции крысы сомнительна: разгрызть дерево ей не предоставит труда!

     Желательно, чтобы пол клетки был не скользким, лучше даже решетчатым. Решетка на полу для стока нечистот не должна вызывать раздражение ладошек у крыс, различные намины и травмы; размер ячейки у решетки не должен позволить лапке грызуна провалиться или застрять. На дне клетки должен находиться съемный поддон. Он должен быть достаточно глубоким, чтобы подстилка и разный мусор не высыпались из клетки. Пластиковые поддоны, в отличие от металлических, более устойчивы к действию мочи, легче моются, не имеют острых углов.

     Где поставить клетку? Где удобнее для Вас и для крысы. Не ставьте клетку на проходе, в коридоре: ее можно уронить, постоянное передвижение людей беспокоят грызуна, а также существует угроза сквозняков. Расположите клетку в доме так, чтобы рядом не было окон или батарей, кондиционеров. Кроме того, необходимо соблюдать световой режим: крысы тоже спят. Постоянное освещение вызывает психический дискомфорт и способствует нарушению репродуктивной функции, образованию кист яичника, что может стать причиной развития опухолевого процесса. Оставьте на ночь полумрак - (ночник или не задернутые шторы).


Что использовать в качестве подстилочного материала?

Подстилка может быть разной, хотя твердый  пол для крысы предпочтительнее мягкого. Очень любит крыса пошуршать бумажками – не используйте для этого газеты и листы с типографской краской. Понаблюдайте за состоянием подошв у крысы – нет ли раздражения от подстилки?

Неплохой  подстилкой может стать бумага из "шредера" - крысам очень интересно  собирать ее в гнездышки или играть в прятки, как в густой траве. Можно  использовать сено или солому, опилки, тонкую и мягкую древесную стружку, шелуху от зерна, специальные наполнители из целлюлозы, опилки прессованные, гранулированные, бумажные салфетки, тряпочки и т.п. Тряпки иногда становятся причиной травм, особенно если ниточки закручиваются вокруг пальцев, стоп или хвоста. По этой причине не используйте тряпки или пряжу для подстилки в гнезде с малышами и кормящей мамой. Зато хорошо подойдет нетканый материал с отличной способностью к впитыванию (кухонные салфетки).

     Избегайте изделий из хвойных пород дерева. Я уже упоминала, что все продукты из хвойных деревьев (сосны, кедра, пихты или ели) содержат ядовитые вещества - ароматические масла (фенолы), придающие специфический аромат древесине. При вдыхании они растворяются в крови и проходят детоксикацию в печени, увеличивая число микросомальных ферментов. Длительное токсическое воздействие приводит к гепатомегалии и иммуносупрессии. Кроме того, хвойные породы содержат кислоты, раздражающие респираторный тракт и повышающие восприимчивость к болезням органов дыхания. Растворяясь в крови, ароматические углеводороды фильтруются через почки, повреждая их. Животные, содержащиеся в деревянных клетках или на подстилке из сосновых опилок, со временем становятся  менее устойчивы к инфекциям, особенно респираторного тракта, а также тяжелее переносят терапию лекарственными препаратами и наркоз.

     Можно использовать наполнители для кошачьего туалета. Но они часто содержат глину и, соответственно, много пыли. Это вредно для легких! Кроме того, мелкие гранулы могут попасть в горло, стать причиной асфиксии и крыса задохнется.

     Гранулированный наполнитель для грызунов – отличный выбор, но он несколько дороговат, обращайте внимание на однородность и состав гранул.

     Смена подстилки производится по мере надобности, но не реже одного раза в неделю. Регулярная смена подстилки позволяет избегать накопления бактерий и аммиака, которые являются причинами многих заболеваний дыхательной системы. Если запах чувствуете Вы, то представьте, что ощущает Ваша крыса?!

     Многие  крысы используют для туалета отдельное место в клетке, поощряйте это и при смене подстилки оставьте для запаха немного помета. В жаркую или влажную погоду чистка клетки должна производиться чаще (раз в день или раз в два дня). Наличие повышенной влажности в клетке (в том числе и от мочи) может стать причиной развития грибка, которые способны попасть в легкие грызуна и вызвать заболевание - микоз, а также стать причиной кишечных расстройств и кожных заболеваний.

     Мыть  клетку можно горячей водой с  содой или мылом, сильные загрязнения оттирайте с помощью щетки. Нельзя использовать хлорсодержащие дезинфектанты на оцинкованных поверхностях. После использования дезинфектантов тщательно промойте клетку. Остатки моющих дезсредств могут стать причиной раздражения кожи и слизистых оболочек, глаз и органов дыхания.

     Температурный режим.

     Крысы - ночные животные, поэтому плохо  переносят высокие температуры. При перегревании крысы не потеют, как люди, и не дышат открытым ртом, высунув язык, как собаки. Для  терморегуляции они используют свой хвост: расширение сосудов приводит к увеличению отдачи тепла. Именно поэтому, бесхвостые крысы так уязвимы к перегреванию и перепадам температур. Перегревание вызывает тепловой удар, вплоть до потери сознания. При заболевании сердца и органов дыхания чувствительность к температурным перепадам резко возрастает.

     По  температуре хвоста на ощупь можно  определить повышена ли температура  тела у Вашей крысы. Обычно хвост - прохладный на ощупь, он не должен быть теплым!

     Для контроля за температурой окружающей среды используйте термометр, разместив его около клетки.

     Если  на улице очень  жарко, то необходимо занавесить окна и поставить клетку на пол, где прохладнее. В ванной комнате обычно прохладнее - поставьте клетку там. Ночью проветривайте комнату, а днем окна закрывайте. Еще один способ - поставьте замороженные кубики льда в клетку, при испарении они охлаждают воздух и дают питьевую воду для крыс (это для них как мороженое). Вместо льда можно использовать замороженные овощи или фрукты, настои трав с соками.

     Можно использовать пульверизатор и устраивать «маленький дождик».

      Пониженные  температуры крысы обычно переносят легче, особенно при наличии хорошей подстилки, куда можно зарыться. Но  очень низкие температуры (зимой) могут привести к переохлаждению животного и обострению хронических заболеваний. Особенно страдают крысы с бедным шерстным покровом (рексы и нудики). Надо обеспечить тепло за счет грелок или специальных обогревательных ковриков, а клетку закрыть и укутать полотном от сквозняков.

   
 

   Питьевая  вода.

     Очень важно, чтобы у Ваших крыс всегда была свежая вода в поилке. Воды крыса выпивает в два раза больше, чем съедает корма. Ежедневно тщательно промывайте все составные части поилки, ошпаривайте их кипятком и убирайте солевые отложения со стенок.

     Внимательно осмотрите поилку после мойки и сборки: хорошо ли поступает вода, не течет ли она. Лучше сделайте метку на внешней поверхности бутылочки, чтобы следить за водным режимом (потреблением воды).

     Для питья лучше использовать бутылированную питьевую воду, либо фильтрованную из-под крана. Фторирование и хлорирование воды делает ее токсичной для грызунов.

     Для животных с заболеванием сердца или  почек используйте воду, обедненную натрием (не выше 150 мг/л).

     Великолепно подойдет для питья талая вода. Заморозьте кубики и оттаивайте их до места «мутного льда» - это соли и «грязь». Талая вода с добавлением капельки меда – живительная влага!

Полезная информация

Возврат товара

Кормам все возрасты покорны

С каждым годом на полках супермаркетов и специализированных магазинов появляется все больше продуктов, а также разновидностей уже существующих линеек. Данная тенденция прослеживается как в продовольственном в сегменте, так и среди зоотоваров. В условиях высокой конкуренции бренды стараются охватить максимально широкую аудиторию и удовлетворить любые потребности покупателей. Как говорится, чем дальше в лес…

В болезни и в здравии. МКБ

Никто не любит болеть. Ощущение слабости, повышенная температура или - еще хуже - острые боли…Даже взрослому человеку не просто справится с этим неприятным состоянием, что уж говорить о беззащитных животных. На страдания этих хрупких и безмолвных существ смотреть всегда особенно тяжело.

Усатый лекарь

Если верить социологам, 60% россиян имеют домашних животных, причем каждая третья семья отдает предпочтение кошкам. Одни заводят этих грациозных хищников, чтобы охранять дом от грызунов, другие хотят получить любовь и ласку, третьи верят, что их хвостатый друг или подруга способны на большее…

Новогодний переполох

Многие любят декабрь за ожидание праздников, предчувствие чудес, запах мандаринов и еловых иголок, блеск елочных игрушек, красиво упакованные подарки, любимые фильмы и яркую иллюминацию улиц. Это самое счастливое и сказочное время года для нас, людей. Но так ли это для тех, кого мы приручили?

Как избежать появления лишнего веса у собаки

Все мы любим своих псов, но зачастую получается так, что на волне этого теплого чувства у нас не выходит объективно взглянуть на их режим питания. Нам начинает казаться, что любимчик не наедается, жалобно просит добавки, грустным взглядом смотрит на миску. ..

Натуральное питание для собак: плюсы и минусы

Когда мы заводим пса, мы не только приобретаем новое развлечение, но и берем на себя серьезную ответственность, которую предусматривает гордое звание хозяина. С этого самого момента благополучие животного зависит именно от вас.

Хищник хищнику не рознь

Мы уже давно считаем их членами семьи, друзьями и компаньонами в делах. Делим с ними заботы, радости, беды, а часто и кровать. Мы любим их, и сходим с ума от волнения, если они заболевают. Мы вместе прошли сквозь века и эпохи и иногда забываем, что в них течет кровь диких хищников. Потому что они, несмотря на свой милый внешний вид, так ими и остались.

Господин Фенхель

Известное с древних времен лекарственное средство — фенхель, приправа из которого ныне является ключевым вкусовым тизером многих кулинарных шедевров кухни Франции и Италии, также очень ценится и производителями кормов для наших гавкающих друзей. В чем же секрет популярности этого невзрачного клубня?

В чем секрет успешной дрессировки?

Бытует мнение, согласно которому существуют очень умные породы собак, называемые «золотой десяткой». Американский профессор-зоопсихолог Стенли Корен утверждает, что к данному списку относятся следующие представители: немецкие овчарки, бордер-колли, золотистые ретриверы, лабрадоры-ретриверы, ротвейлеры, доберманы, австралийские скотогонные, пудели, папильоны, шелти. Перечисленные породы собак осваивают новую команду буквально за 5 повторений, а также выполняют задания дрессировщика в среднем в 95% случаев.

Как обустроить клетку для крысы. Аксессуары для клеток. - АКВАРИУМНЫЕ и ЗОО ТОВАРЫ

Крысы не только очень умные, но и крайне подвижные и любопытные зверьки, в связи с чем правильное обустройство крысиной клетки имеет большое значение для комфортного проживания в ней грызуна.

Покупать и обустраивать клетку для крысы следует до приобретения питомца. Клетка крысе нужна достаточно высокая, с несколькими ярусами. Ярусы могут быть сплошными и решетчатыми, первые удобнее для зверька и менее травматичны.

Крысы социальны и нуждаются в общении, если вы планируете завести одно животное, то придется компенсировать недостаток общения с сородичами большим количеством развлечений.

Беговое колесо крысе не нужно, зверек использует его по назначению максимум пару раз, а потом приспособит под свои нужды. К тому же на колесах крысы часто травмируются, вывихнутая лапка или поломанный хвост – это результат наличия в крысиной клетке бегового колеса.
А вот подвесные игрушки, разные колокольчики и даже птичьи жердочки очень порадуют вашу крыску.

Клетки для крыс

В клетку крысам часто устанавливают тоннели из пружин. Молодые крысы с удовольствием исследуют подобные игрушки, а вот для взрослых особей тоннель опасен, особенно если зверек из него давно вырос. Застрявшую в таком тоннеле крысу извлечь порой очень сложно.

Крысы обожаю домики и гамаки. Домик лучше приобретать пластиковый и без дна, так его легче убирать. Деревянные домики быстро приходят в негодность из-за зубов крысы и способности дерева впитывать влагу. Домики крысы в основном используют как укрытие, а в гамаке зверек может отдыхать и одновременно наблюдать за всем вокруг. Приготовьтесь к тому, что гамаки требуют частой замены. Крыски для лучшего обзора происходящего под ними прогрызают в гамаках «окошки», а когда спать на нем становится совсем неудобно, превращают в мелкие кусочки ткани.

Вообще крысы довольно привередливы в отношении развлечений и игрушек. Им быстро все надоедает и постоянно нужно что-то новенькое для изучения. Можно конечно ограничить крысу в игрушках, но тогда она станет вялой, апатичной и толстой. А ведь вы не для этого заводили себе зверька?

Корм и витамины, товары и аксессуары для грызунов

Обязательно поместите в клетку для крыс ниппельную поилку и подвесную кормушку. Обычные миски крысы почти всегда переворачивают, что сказывается на гигиене клетки, окружающего пространства и здоровье грызуна, вынужденного находится в мокром помещении.

Особого внимания требует выбор наполнителя. Самый подходящий для крыс вариант – это прессованный древесный или кукурузный наполнитель. Оба вида экологичны, безопасны и отлично впитывают запах с влагой. Наполнитель насыпается на дно клетке на 3-5 см.

Оборудование комфортного жилища для крысы не требует особых усилий, достаточно желания сделать жизнь питомца приятной и радостной, и конечно немного фантазии.


Клетка для крыс | Ратмания

Многие ошибочно считают, что клеткой для крысы может служить любая емкость. Так, можно наткнуться на упоминания о том, что крыса живет в аквариуме или еще чаще, что ей приходится существовать в маленькой хомячьей клетке, по принципу «ей и так хорошо!». Не лучше дело обстоит и с обустройством такого крысиного жилища: домик, миска, поилка и нередко еще колесо, занимающее львиную долю клеточного пространства — вот и всё, что туда помещается. К сожалению, для крысы, активного высокоразвитого животного, такие условия существования сравнимы разве что с тюремным заключением, а комфортные условия выглядят несколько иначе.

Варианты клеток

На первый взгляд ассортимент клеток и других вроде бы подходящих для крыс жилищ довольно обширен. Особенно, если послушать «компетентных» продавцов-консультантов зоомагазинов. К сожалению, часто бывает так, что такие консультанты видели крысу разве что на картинке, поэтому разбираются в них чуть больше, чем никак, и продают новичкам слишком маленькие, неподходящие или даже травмоопасные варианты, при этом снабжая покупателей рассказами о том, что это прямо-таки идеальный крысиный крысодом. А потом эти новички, придя на какой-нибудь крысиный тематический форум, бывают весьма удивлены, что опытным крысодам их новая клетка не понравилась и вызвала волну критики. Почему это происходит? Давайте, рассмотрим несколько распространенных, но ошибочных вариантов таких покупок.

Террариум, аквариум

Плюсы: многие считают, что их очень легко убирать, запах животных не распространяется по комнате, животное защищено от любого сквозняка и наполнитель никогда не летит на пол.
Минусы: но при этом они забывают упомянуть об обратных сторонах медали. Например о том, что в террариумах и аквариумах невозможно добиться достаточного уровня вентиляции, чтобы животному не приходилось жить в испарениях отходов жизнедеятельности, а одной верхней вентиляции (аквариум) или боковой (террариум), увы, не достаточно, поэтому, сколь бы часто вы ни убирались у крыс, их легкие день за днем будут разъедать пары аммиака. Недостаточная проветриваемость означает и то, что в таком жилище будет постоянно поддерживаться очень высокая температура, что может привести к перегреву или даже летальному исходу. И к тому же за стеклом крысы будут совершенно изолированы от вас и происходящего в квартире, а это не лучший выбор для поддерживания отношений со столь социальными животными.

Пластиковая клетка (т.н. «дюна»), пластиковый контейнер

Плюсы, и, что главное, минусы у таких клеток и контейнеров те же самые, что и у террариумов и аквариумов. Но несмотря на это, в «дюнах» (изображения 1, 2) некоторые заводчики несколько дней содержат родившую самку и ее потомство — в них самка чувствует себя в безопасности и минимален риск травмировать кого-то из детей, в то время как в клетке крысята могут пролезть сквозь прутья или, что еще хуже, застрять между ними. Но для постоянного содержания крыс такая клетка непригодна. Контейнеры не подходят даже для временного проживания крыс.

Клетка для мышей/хомяков

Плюсы: по мнению многих, эти клетки хороши тем, что занимают очень мало места, к тому же они дешевые и их легко мыть и переносить, а на то, что они очень маленькие, отвечают как обычно «и так сойдет!».
Минусы: и цена, и компактность, и легкость достигаются при помощи лишь одного аспекта — такие клетки чрезвычайно малы! Настолько малы, что взрослая крыса в них не может даже вытянуться во всю длину или потянуться, встав на задние лапы. Для человека это помещение площадью примерно 2м х 2м и высотой 1,5м. Подумайте, каково вам будет жить, есть, спать, справлять нужду и проводить большую часть вашего времени в комнате, величиной с туалет. Это не преувеличение и не «очеловечивание» животных — это лишь сравнение, и т.к. человек не обладает той потребностью в физической активности, что и крыса, то крысе в такой ситуации приходится даже хуже. Еще одним минусом этих клеток являются узкие тоннели и лазы, маленькие колеса и домики — крысе ничего не стоит застрять или травмироваться, а через маленькую дверцу вы не сможете вытащить упирающееся животное, а такая необходимость может возникнуть в любой момент.

Выбор клетки

На данный момент почти идеальным вариантом является просторная клетка с пластиковым поддоном и окрашенными прутьями. При этом важно учесть некоторые моменты:

Размер клетки

Минимальный размер клетки на двух крыс (или одну, если вы, к сожалению, содержите только одну крысу) должен составлять не менее 120.000 см³. Дальнейший «лимит» клетки высчитывается следующим образом: перемножаются длина, ширина и высота клетки и результат делится на 50.000 — полученная цифра и есть максимальное количество крыс, которые могут жить в этой клетке. При этом основание (поддон клетки) не должно быть менее 40 х 60 см, а высота не должна быть меньше 50 см. Это абсолютный минимум, намного комфортнее животным будет в более просторной клетке! Для временного содержания (например, на время карантина, для маленьких крысят, для отсаживания больных животных или животных после операции) подойдет и более мелкая клетка.

Формат клетки

Формат клетки, т.е. отношение между длиной, высотой и шириной, для крыс любого пола должен быть таким, чтобы клетка не казалась «плоской» (слишком большое основание при маленькой высоте), «башней» (слишком большая высота при маленьком основании) или просто не была слишком узкой при большой высоте и длине. Например, не имеет смысла клетка с минимальным основанием 40 х 60 см и высотой более 80 см. Такая клетка будет неудобна для крыс и неустойчива. Для высоты более 80 см минимальное основание должно быть около 50 х 70 см, тогда клетка будет более органичной и комфортной. Также для крыс не слишком удобны клетки с минимальной высотой (50 см), даже если основание при этом будет буквально огромным (скажем, 70 х 100 см). Крысы не равнинные животные, им очень важна многоуровневость жилища! Конечно, исключением являются пожилые и больные крысы, которые передвигаются  лишь по поддону, а карабкаться наверх уже не могут, не хотят или это было бы для них слишком травмоопасно. Слишком узкие клетки (с минимальной шириной 40 см) еще могут условно считаться удобными при размерах других сторон, также близких к минимальным, однако при увеличении длины и высоты недостаточная ширина будет всё больше бросаться в глаза. Особенно хотелось бы подчеркнуть, что и самки, и самцы должны жить в клетках, соответствующих их видовой, а не половой принадлежности. «Башня» будет неудобной и травмоопасной как для крупных массивных самцов, так и для активных самок, а «плоская» и слишком низкая клетка будет и для тех, и для других банально скучна и неинтересна.

Расстояние между прутьями

Максимальное расстояние между прутьями не должно превышать 1,7 см. Для взрослых самцов позволительны и 2 см, но это относится действительно только к крупным, взрослым самцам, самки и крысята могут «просачиваться» сквозь прутья.

Обработка прутьев

Существуют как варианты клеток с окрашенными прутьями, так и с оцинкованными. Различие лишь одно: оцинковка вбирает в себя запахи и быстро окисляется, образовывая на поверхности прутьев белые пятна, неопасные для здоровья животных, но неэстетичные с точки зрения человека.

Фальшдно

Наличие фальшдна позволяет избежать проблем с выкидыванием наполнителя из клетки и контактов животных с отходами их жизнедеятельности, улучшив тем самым гигиеничность жилища. С другой стороны наличие фальшдна повышает травмоопасность клетки для крыс (вывихи и переломы), может привести к травмированию нежной кожи ступней и развитию пододерматита (натоптышей), и под него может затекать и скапливаться моча. Поэтому однозначного ответа на вопрос «быть или не быть» фальшдну не существует и каждый крысовод решает его для себя сам, методом проб и ошибок. Если вы решите использовать клетку с фальшдном, то лучшим решением будет закрытие средней его части плотным материалом (линолеум, картон, коврик ПВХ и др.), который снизит травмоопасность.

Примеры клеток

На примере клеток производителя Ferplast можно получить примерное представление о соотношении «размер клетки — максимальное количество животных»:

Почитать о клетках крысоводов, задать интересующие Вас вопросы или показать свою клетку вы можете в этом обсуждении на форуме.


Автор текста Katharina From

Выбираем и обустраиваем клетку для декоративных грызунов | Обзорные статьи

28.09.2013

 

«Мама, давай купим хомячка!» - с этой фразы начинается половина посещений зоомагазинов или птичьих рынков. И как результат, на радость чаду в квартире поселяется забавный декоративный грызун. Потому что не только детям, но и многим взрослым нравиться идея завести маленького домашнего питомца. Разного рода ручные хомячки, мышки, крысы, шиншиллы  с точки зрения будущих владельцев менее проблематичны в уходе: выгуливать не надо, живут в клетке, едят мало. Также нельзя не отметить их необычайную любознательность, подкупающее дружелюбие и привязанность к хозяевам. Многие из этих животных, оказывается,  поддаются дрессировке. Дети, которые ухаживают за ручными зверьками, параллельно развивают в себе ответственность и аккуратность. Ну, просто идеальные домашние питомцы, не правда ли?

 

Но не все так просто с декоративными грызунами.  Да, их легко содержать дома, но, как и любое другое живое существо, они требуют  правильного ухода, соответствующего питания и соблюдения правил гигиены. А главное, клетка – место их постоянного обитания в вашем доме, должна полностью удовлетворять их образ жизни и потребности, а также учитывать размеры грызунов.  От этого всего  зависит здоровье вашего питомца и его долголетие.

 

Если это вас не пугает, смело поддавайтесь на уговоры и приобретайте  нового члена семьи.  Но прежде купите для него подходящую клетку, в которой ваш питомец будет чувствовать себя уютно и комфортно. В зоомагазинах сейчас можно приобрести  не просто пустую клетку из пластика и металлической решетки,  а настоящий оборудованный дом, куда входит посуда для пищи и воды, спальное место и разные игрушки. А теперь поподробнее о том, каким должен быть дом у двух самых популярных видов декоративных грызунов – хомяка и крысы.

 

 


Требования к клеткам для хомяков.

 

Для таких маленьких грызунов, как хомячки, лучше всего подходит клетка с горизонтальными прутьями. Вертикальные прутья допускаются, если хомяк не из той породы, которая любит перемещаться по стенам. При выборе размера клетки тоже отталкиваются от породы животного. Например, для карликовых пород будет вполне достаточно жилья высотой около 28-30 см  и длиной 50 см. Для крупных пород жилое пространство должно быть куда более просторным, его идеальные размеры -  высота 40 см и длина 60 см. Так как хомяки легко перегрызают многие материалы, очень важно из чего сделаны проволочные прутья.  Выбирайте клетки, сделанные из хромированной стали.

 

В природных условиях все грызуны селятся в норах, и одомашненные хомяки  также предпочитают подобные места для сна и отдыха. Так как копать настоящие норы у них не получится, были разработаны специальные домики-норки, куда засыпается целлюлоза, в которую хомяк может зарыться. Выбирайте такую конструкцию домика, чтобы она хорошо проветривалась  и легко мылась.

 

Если вы решились обустроить клетку вашего питомца по высшему разряду, позаботьтесь о том, чтобы в ней были и другие приспособления, которые разнообразят жизнь  вашего грызуна и сделают ее нескучной. Хомяки, хоть и любят большую часть дня поспать, тем не менее, с наступлением сумерек начинают вести активный образ жизни. Эти зверьки просто не смогут обойтись без того, чтобы не побегать и не полазить где-нибудь. Поэтому в клетке должны обязательно быть различные декоративные веточки, трубочки, лабиринты, препятствия, создающие в клетке несколько ярусов,  колеса с поперечными перекладками, которое легко крепиться к стенке или устанавливается на полу клетки.

 

Для хомяков карликовых пород, например джунгарских, не нужна проволочная решетка, потому что они почти не лазают вверх.  Для таких пород можно приобрести специальные террариумы для грызунов – для вентиляции им достаточно открытого широкого верха . Высокие и узкие аквариумы совершенно не пригодны для жизни декоративных грызунов – в них очень быстро запотевают стенки, на которых тут же размножаются болезнетворные бактерии, повышается влажность и затрудняется  доступ к свежему воздуху.

 

Пожалуй, лучшим вариантом жилья для хомяков  будет сборная искусственная нора. Это целый  комплекс, состоящий из нескольких модулей и переходов в виде труб, причем варианты комбинаций почти бесконечны – все зависит от вашего желания, финансовых возможностей и места в квартире.

 

Мало купить клетку и создать там условия для жизни и развлечений. Также нужно подумать о туалете из специального наполнителя, способного поглощать неприятные запахи и влагу. Менять такой наполнитель достаточно один раз в неделю.  Подстилкой в клетке могут служить спрессованные опилки  или  наст с добавлением древесной  стружки. Для карликовых пород лучше приобретать специальный мелкий песок. Использовать текстильные или бумажные подстилки, в том числе газеты, журналы и разные тканые материалы категорически не рекомендуется.

 

 


Требования к клеткам для крыс.

 

Декоративные крысы довольно крупный вид грызунов, которые  предпочитают активное времяпровождение.  Поэтому таким питомцам требуется куда больше жилого пространства, чем хомякам и мышкам. Считается, что для комфортного существования каждой взрослой крысе необходимо не меньше 40 квадратных сантиметров площади. Клетка для этих животных должна быть удобной и надежной, с широкими дверцами, которые  хорошо фиксируются в закрытом положении. Это важно, так как крысы очень сообразительные и легко могут вскрыть замок и сбежать из клетки наружу.

 

 

Как и в случае хомяков, в качестве жилья для крысы  совершенно не подходит обычный, даже  очень большой  стеклянный аквариум.  Он очень плохо проветривается и имеет свойство скапливать на дне углекислый газ. Как вы понимаете, такой дом представляет  собой потенциальную угрозу жизни для вашего питомца. 

 

Специальная клетка для крысы имеет вид металлической в основном хромированной стальной сетки и отсоединяемого пластмассового поддона. Ее высота должна составлять примерно 40см, при наличии хотя бы двух этажей - 80см. В клетке для крыс  особенно  приветствуется наличие нескольких этажей, желательно не ниже 20 см каждый, чтобы взрослая крыса могла становиться в полный рост.  Прутья сетки должно быть расположены не меньше чем на12 мм друг от друга, чтобы в клетке для крысы было достаточно светло, и работала нормальная вентиляция.  Пластиковые поддоны давно вытеснили деревянные, так как  не впитывают в себя жидкость или очень легкие в плане ухода и мытья.

 

Пустая клетка никогда не станет настоящим домом для вашего питомца, если там не будет теплого пола и удобной мебели.  На дно крысиной клетки обязательно стелют подстилку – без нее животному будет некомфортно. Можно приобрести специальный наполнитель для клеток грызунов или использовать обычную деревянную стружку. Не стоит заменять подстилку газетами и журналами, типографская краска которую используют для их печати,  вредна  для кожи и шерсти грызунов.  Также рекомендуют отказаться от мелких опилок, поскольку они могут попасть в глаза и дыхательные пути крысы.

 

Как мы упоминали выше, крыса – это активное животное, которое любит постоянно перемещаться с места на место. Для обустройства клетки также незаменимы всевозможные полки, тоннели и лесенки. Крутящееся колесо, предназначенное для хомяков, приобретать не желательно. Даже в самое большое колесо взрослая крыса не поместится, а у маленького животного  оно может стать причиной травмы хвоста. Очень важно, чтобы в клетке для крысы были всевозможные  «гнезда-домики», которые служат местом для ночлега, отдыха или игры в прядки. Можно приобрести разные домики, подвесные гамаки, шарики и норки.

 

 

 

Уход за хомяками и крысами не требует специальной температуры или влажности воздуха. Для комфортной жизни  клетку декоративной крысы достаточно разместить в месте, где нет сквозняков, сырости и  прямых солнечных лучей.  Помимо всего есть общие правила по уходу за клетками  абсолютно всех пород декоративных грызунов. Не забывайте делать регулярную уборку в клетках и дезинфицировать их.  Посуда, мебель  и  разный инвентарь также нуждается в чистоте и обеззараживании. Все элементы клетки желательно промывать кипятком и просушивать, поддон регулярно обрабатывать 5-10%-ным раствором щелочи или креолином. Если есть такая необходимость, клетку нужно обрабатывать  средствами против эктопаразитов. Ведь остатки еды, кал и испарения продуктов жизнедеятельности отрицательно влияют на общее здоровье питомца.

 

крыс!

Dis Model Mech. 2009 май-июнь; 2 (5-6): 206–210.

Филип М. Ианнакконе

1 Программа биологии развития, Детский мемориальный исследовательский центр, Северо-Западный университет, Чикаго, Иллинойс 60614, США

Ховард Дж. Джейкоб

2 Департамент физиологии, педиатрии, человека и молекул Центр генетики, Медицинский колледж Милуоки, Висконсин 53226, США

1 Программа биологии развития, Детский мемориальный исследовательский центр, Северо-Западный университет, Чикаго, Иллинойс 60614, США

2 Департамент физиологии, педиатрии, человека и молекул Центр генетики, Медицинский колледж Милуоки, WI 53226, США

Эта статья цитируется в других статьях в PMC.

В качестве модели человеческого заболевания крыса имеет много преимуществ по сравнению с мышью и другими организмами. Фактически, когда-то крысы были наиболее широко используемым организмом в медицинских исследованиях, и успешное выделение крысиных ES-клеток быстро расширит их полезность.

Китайский календарный год крысы оправдал свое название. К концу года было опубликовано пять статей, описывающих методы получения плюрипотентных стволовых клеток крыс. Некоторые методы способны обеспечить доступ к зародышевой линии крысы, что должно привести к созданию ценных моделей заболеваний человека (Buehr et al., 2008; Ли и др., 2008; Ли и др., 2009; Ляо и др., 2009; Ueda et al., 2008). Это знаменует собой успешное завершение усилий, которые длились более 15 лет и почти на 30 лет отстают от аналогичного достижения мыши. Это не конец, а начало. Теперь работа должна установить те же надежные методологии нацеливания на крысу, которые доступны для мыши. Перспективы технологии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPS) для крыс должны получить более широкое признание. Методологию необходимо интегрировать в большой и расширенный набор инструментов для генома крысы.Мы думаем, что полезно рассмотреть причины, по которым этот прогресс может иметь важное значение, помимо символики процветания, которую крыса воплощает в китайском календаре.

Почему крыса?

Учитывая, что для мышей доступно множество технологий функциональной геномики, насколько важна крыса как модельный организм? За последние 30 лет исследователи решили использовать модели мышей из-за доступных технологий. Теперь, когда те же технологии доступны и с крысами, ученые смогут выбрать наиболее подходящую модель на основе биологии, будь то крыса, мышь или и то, и другое.Несмотря на то, что эти виды похожи друг на друга, крысы и мыши разделяют миллионы лет эволюции, и между ними есть существенные различия.

В качестве модели человеческого заболевания крыса имеет много преимуществ по сравнению с мышью и другими организмами. Фактически, когда-то крысы были наиболее широко используемым организмом в медицинских исследованиях, и успешное выделение крысиных ES (эмбриональных стволовых) клеток быстро расширит их применение. Крыса - отличная модель сердечно-сосудистых заболеваний, особенно инсульта и гипертонии, и существует множество генетических групп, которые идеально подходят для этих исследований.У крыс легче контролировать физиологию, и со временем накопился объем данных, на воспроизведение которых у мыши уйдут годы. Более того, во многих случаях физиология больше похожа на соответствующее состояние человека. В исследованиях познания и памяти крыса превосходит другие модели, потому что физиологические системы, участвующие в обучении и памяти, были так тщательно изучены у этого животного. Крыса умнее мыши и способна выполнять более широкий круг задач, важных для когнитивных исследований.Размер животного позволяет использовать его в качестве модели заболевания не только из-за способности выполнять хирургические процедуры, но и из-за пропорционального размера важных субструктур в органах, который влияет как на то, сколько органа вовлечено в экспериментальное поражение. и отдаленные эффекты введения лекарства в определенные анатомические области. Это особенно важно для центральной нервной системы. Модели рака груди у крыс превосходят таковые у мышей, поскольку они гормонально чувствительны к гистопатологии и имеют предраковые стадии, которые больше напоминают человеческое заболевание.Крыса является основной моделью для изучения механизмов воспроизводства человека. В моделях диабета модель на крысах ведет себя больше как болезнь человека во многих важных аспектах, включая способность факторов окружающей среды (например, токсинов, стресса, диеты и вакцинации) изменять болезнь. Для исследований лекарственных препаратов размер крысы позволяет проводить серийные заборы крови. Это ни в коем случае не исчерпывающий список, но он дает представление о глубине и диапазоне использования данной модели на животных.

Недавний поиск данных в PubMed выявил более 1 миллиона публикаций, в которых используется крыса.Доступна информация о более чем 100-летнем опыте фенотипирования. Крыса стала стандартизированной физиологической и токсикологической моделью, особенно в фармацевтической промышленности. Существует широкий спектр штаммов, поддерживающих обширную литературу по сравнительной физиологии и, в последнее время, сравнительной геномике. Ряд моделей, которые хорошо подходят для изучения болезней человека или более подходят, чем мыши, был недавно подробно представлен (Aitman et al., 2008). Однако создание специфических мутаций, условных мутаций и манипуляций с маркерами, например, в моделях knock-in, у крыс было проблематичным. Справедливо сказать, что функциональные геномные исследования в различных областях, в которых крыса является ценной животной моделью болезни человека, включая те, которые обсуждались выше, были предотвращены или затруднены из-за ограничений в направленном манипулировании геномом крысы.

Что не хватает?

Ряд приоритетных встреч был проведен почти десять лет назад при спонсорской поддержке Национальных институтов здоровья (NIH), чтобы определить, как лучше всего облегчить использование крыс в качестве модельных организмов.Встречи выросли из активной активности внутри сообщества и начались с проводимых раз в два года встреч по трансплантации под названием «Аллоантигенные системы у крысы». Время от времени эти встречи, на которых присутствовала международная группа из нескольких сотен ученых, были сосредоточены на генетических проблемах, характерных для крыс. В течение ряда лет был достигнут консенсус в отношении того, что национальное хранилище, гарантирующее генетическую и микробиологическую целостность многих штаммов, используемых во всем мире, крайне необходимо. Предполагалось, что такая организация будет сотрудничать с аналогичными лабораториями со всего мира, создавая надежный и стандартизированный источник определенных штаммов, и сможет стандартизировать распространение моделей крыс.

Примерный план хранилища и того, чего не хватало при исследованиях на крысах, подробно обсуждался на встрече, состоявшейся в Лансдауне, штат Вирджиния, в 1998 г. (http://www.nhlbi.nih.gov/meetings/model/index.htm). В то время обсуждался набор генетических инструментов для крысы. Помимо стандартизации и распространения обычных линий крыс, было совершенно ясно, что работе с крысами мешает отсутствие полных данных о геноме и трудности с генетической модификацией линий крыс. Многие части, необходимые для успешного секвенирования генома крысы, уже были доступны, но целенаправленная генетическая модификация была невозможна.В то время не было доказанных стволовых клеток, компетентных в отношении зародышевой линии, и не было даже основных методов культивирования in vitro ранних эмбрионов крыс. В то время даже создание трансгенных крыс было относительно неэффективным.

За встречей в Лансдауне в 1999 г. последовало приоритетное собрание, спонсируемое Национальным институтом здравоохранения (NIH), на котором были подтверждены основные цели по расширению исследований на крысах. Была организована поддержка национального репозитория штаммов, усилий по генетической модификации и завершения последовательности генома за счет усиления геномных инструментов.В обоих отчетах о встречах подчеркивалась необходимость более широкого участия исследовательского сообщества, использующего эту модель, и взаимодействия с другими модельными системными исследовательскими сообществами (http://www.nhlbi.nih.gov/resources/docs/ratmtgpg.htm). С тех пор, как в 2004 году был опубликован проект последовательности генома крысы, инструменты генома продолжали расширяться. Это в значительной степени связано с организацией международных усилий Национальных институтов здравоохранения и Европейского союза (ЕС) по достижению целей, изложенных в отчетах, а также по решению новых геномных приоритетов.Совсем недавно это стало частью шестой рамочной программы ЕС в его модуле EURATools (http://www.euratools.eu).

После этих встреч был проделан значительный объем работы. Центр ресурсов и исследований крыс в настоящее время является надежным национальным хранилищем. Были разработаны методы, позволяющие культивировать эмбрион крысы из одной клетки в бластоцисту (Iannaccone et al., 2001; Yang et al., 2004; Zhou et al., 2003). Доступен высококачественный проект последовательности генома крысы.Аннотации и сравнительные геномные инструменты сейчас широко распространены (например, Rat Genome Database, RGD, http://rgd.mcw.edu). Кроме того, методы лентивирусной трансформации делают трансгенных крыс легко доступными. Теперь у нас есть элегантная схема, которая позволяет отобрать специфические мутантные штаммы крыс после мутагенеза N, -этил- N -нитрозомочевины (ENU) (Zan et al., 2003). Результаты консорциума ЕС были недавно опубликованы в специальном выпуске журнала Nature Genetics (май 2008 г.), демонстрируя силу совместных усилий в исследовании генома.Осталось разработать методологию стволовых клеток, которая обеспечила бы более продвинутый доступ к зародышевой линии для сайт-ориентированных нокаутов, нокаутов, условных мутаций, систем клеточных маркеров и других подходов, которые стали бы возможными с помощью методов гомологичной рекомбинации. .

Зарождение стволовых клеток

В 1960-х и 1970-х годах Пирс, Стивенс и другие наблюдали стадии развития тератокарциномы в семенниках мышей и тератом яичников у определенных линий мышей.Их исследования пришли к выводу, что партеногенное деление ооцитов в яичниках приводит к образованию эмбриональных структур, которые морфологически неотличимы от стадий дробления, морул и бластоцитов; более того, они утверждали, что гнезда недифференцированных клеток были стволовыми клетками, дающими начало опухоли со всеми ее дифференцированными тканями. Таким образом, идея о том, что эмбриоподобные плюрипотентные стволовые клетки находятся в этих опухолях, привела Солтера, Минца, Гарднера, Папайоанну и других к целенаправленному созданию тератокарцином путем эктопической трансплантации эмбриональных тканей (Evans, 1981).Вскоре последовало выделение в культуре стволовых клеток, называемых клетками EC (эмбриональная карцинома), и было показано, что эти клетки участвуют в образовании химер. Затем Эванс, Мартин и другие попытались выделить стволовые клетки путем культивирования бластоцист непосредственно in vitro и преуспели в создании культур ES-клеток, которые, как было показано, производили функциональные гаметы в химерах. Фермент, спасающий пурины, гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансфераза (HGPRT) был мутирован с помощью ретровирусной вставки и стал первой нулевой мутацией у мышей, продуцируемой с помощью ES-клеток, обеспечивая важную модель синдрома Леша-Нихана (Kuehn et al., 1987).

Ученые усердно пытались выделить одни и те же ES-клетки из различных штаммов эмбрионов крыс, но безуспешно (Brenin et al., 1997). Первичной опухолью зародышевых клеток у мышей является тератокарцинома, и считается, что это коррелирует со способностью изолировать ES-клетки из наростов бластоцисты. У крыс первичной опухолью зародышевых клеток является карцинома желточного мешка, и в соответствии с этим многие лаборатории сообщают, что выросты бластоцисты по внешнему виду напоминают энтодерму и экспрессируют маркеры энтодермы.Недавно пул предшественников экстраэмбриональной энтодермы (XEN-P) был выделен из бластоцист крыс (B. Debeb, V. Galat и J. Epple-Farmer et al., Неопубликовано), но эквивалент предшественника эпибласта в культуре клеток in vitro. клетки или ES-клетки до сих пор оставались неуловимыми.

Au courant

Самая убедительная из пяти новых публикаций, описывающих методы выделения ES-клеток, была опубликована в лаборатории Остина Смита (Buehr et al., 2008). Смит и его коллеги изучили важные пути передачи сигналов и пришли к выводу, что клетки-предшественники эпибласта вынуждены дифференцироваться.Поскольку они знали, что фактор роста фибробластов 4 (FGF4) опосредует дифференцировку посредством передачи сигналов внеклеточной регулируемой киназой (ERK) MAP-киназы (MEK), они использовали известный ингибитор рецепторов FGF (FGFR), чтобы предотвратить это. Когда одно только ингибирование FGFR оказалось недостаточным, они добавили ингибиторы MEK и киназы гликогенсинтазы-3 (GSK-3). Это позволило плюрипотентным недифференцированным клеткам расти в культуре. Клетки были способны создавать химеры [визуализированные маркером зеленого флуоресцентного белка (GFP)], ключевую характеристику ES-клеток.Однако лаборатория не смогла получить потомство из функциональных гамет, происходящих из ES-клеток, в химерах, что является необходимым шагом для доказательства пригодности ES-клеток. Команда пришла к выводу, что плейотропные эффекты отключения передачи сигналов FGF привели к тому, что популяция клеток была каким-то образом неадекватной, а появление аномалий в химерах заставило их удалить ингибиторы FGFR. Этот новый режим культивирования с двумя ингибиторами позволил выделить ES-клетки из бластоцист крысы, которые образовали химеры, компетентные в отношении зародышевой линии.Микросателлитный анализ показал, что потомство одной химеры имеет генетический отпечаток ES-клеток. Путем добавления фактора ингибирования лейкемии (LIF), которого достаточно для предотвращения дифференцировки ES-клеток у мышей, но не у крыс, они разработали ES-клетки, способные к длительному пассажу. Эти ES-клетки также трансформировали трансфекцией маркером линии GFP, что позволяло визуализировать вклад ES-клеток в ткани химер. Было бы желательно увидеть GFP-меченные ES-клетки в потомстве химер, поскольку это дало бы однозначный внешний маркер происхождения потомства и свидетельство того, что генетически модифицированные ES-клетки все еще являются компетентными для зародышевой линии.Несомненно, этот эксперимент приближается. Аналогичные результаты были опубликованы в Li et al. (Ли и др., 2008). В экспериментах, описанных в других рукописях, клетки либо не использовались для создания химер, либо, если были сделаны химеры, они не давали потомства; следовательно, эти ES-клетки следует считать недоказанными, но многообещающими в настоящее время.

Трансфекция клеток несколькими ключевыми факторами транскрипции достаточна для перепрограммирования взрослых клеток до эмбрионального состояния и получения проверенных ES-клеток у мышей.Эти индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPS) обладают всеми характеристиками ES-клеток. В недавно опубликованном интересном и, возможно, важном подходе использовались ингибиторы сигнальной трансдукции из работы Смита в культуре iPS-клеток (Li et al., 2009). Это привело к появлению популяции стволовых клеток, способных образовывать химеры, но о потомстве еще не сообщалось. Технология iPS может преодолеть барьеры напряжения, которые могут существовать при изоляции крысиных ES-клеток. Этот метод также может облегчить выделение стволовых клеток крыс от редких животных.

Оглядываясь назад, неудивительно, что бластоцисты крысы и мыши отличаются, и длительное время, необходимое для развития крысиных ES-клеток, отражает усилия, которые потребовались для понимания этих ключевых различий. Неспособность одного LIF предотвратить дифференцировку культивируемых клеток эпибласта - это только одно отличие. Наша информация о ES-клетках и культивируемых внеэмбриональных клетках-предшественниках эктодермы говорит нам, что внутренняя клеточная масса представляет собой гетерогенную популяцию слабо коммитированных клеток. У разных видов они по-разному сбалансированы или предвзяты.

Дополнительные достижения стволовых клеток являются многообещающими результатами с использованием нуклеаз цинковых пальцев, где гены могут быть нацелены на мутацию у крыс без образования ES-клеток. Эта технология также может допускать изготовление моделей под давлением. Поле кишит неопубликованными сообщениями о результатах нокаута у крыс, которые использовали ту же систему, которая была недавно опубликована с использованием рыбок данио (Ekker, 2008). После долгой и упорной борьбы, несколько методов могут быть ориентированы на гены крысы и значительно улучшить удобство манипулирования крысы в ​​качестве модельного организма.

В «Первооткрывателях» Бурштейн цитирует Тургенева, который писал в письме к Толстому: «Система подобна хвосту истины, а истина - ящерице; он оставляет свой хвост в ваших пальцах и убегает, прекрасно зная, что в мгновение ока вырастет новый ». Экспериментальные системы постоянно развиваются, и использование наиболее подходящей системы для данного эксперимента - лучший путь к истине. Но для использования такой системы, как целевые мутации у крыс, требуются необходимые инструменты. Успешное выделение ES-клеток из бластоцист крысы является ключевым инструментом этой давней и важной модельной системы.

ССЫЛКИ

  • Aitman T.J., Critser J.K., Cuppen E., Dominiczak A., Fernandez-Suarez X.M., Flint J., Gauguier D., Geurts A.M., Gould M., Harris P.C., et al. (2008). Прогресс и перспективы генетики крыс: взгляд сообщества. Нат Жене. 40, 516–522 [PubMed] [Google Scholar]
  • Бренин Д., Лук Дж., Бадер М., Хубнер Н., Леван Г., Ианнакконе П. (1997). Эмбриональные стволовые клетки крысы: отчет о прогрессе. Transplant Proc. 29, 1761–1765 [PubMed] [Google Scholar]
  • Buehr M., Мик С., Блэр К., Янг Дж., Юре Дж., Сильва Дж., Маклей Р., Холл Дж., Ин К. Л., Смит А. (2008). Захват подлинных эмбриональных стволовых клеток из бластоцист крысы. Cell 135, 1287–1298 [PubMed] [Google Scholar]
  • Ekker S.C. (2008). Нокаутирующие удары на основе цинковых пальцев для генов рыбок данио. Zebrafish 5, 121–123 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Эванс М. (1981). Происхождение клеток эмбриональной карциномы мыши и возможность их прямого выделения в культуру ткани. J. Reprod.Fertil. 62, 625–631 [PubMed] [Google Scholar]
  • Iannaccone P., Taborn G., Garton R. (2001). Преимплантационное и постимплантационное развитие эмбрионов крыс, клонированных с кумулюсными клетками и фибробластами. Zygote 9, 135–143 [PubMed] [Google Scholar]
  • Куен М.Р., Брэдли А., Робертсон Э.Дж., Эванс М.Дж. (1987). Потенциальная животная модель синдрома Леша-Найхана путем введения мышей мутаций HPRT. Nature 326, 295–298 [PubMed] [Google Scholar]
  • Ли П., Тонг К., Мериан-Шай Р., Jia L., Wu N., Yan Y., Maxson R.E., Schulze E.N., Song H., Hsieh C.L. и др. (2008). Зародышевые компетентные эмбриональные стволовые клетки, полученные из бластоцист крысы. Cell 135, 1299–1310 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Li W., Wei W., Zhu S., Zhu J., Shi Y., Lin T., Hao E., Hayek A. ., Дэн Х., Дин С. (2009). Создание плюрипотентных стволовых клеток крысы и человека путем сочетания генетического репрограммирования и химических ингибиторов. Cell Stem Cell 4, 16–19 [PubMed] [Google Scholar]
  • Ляо Дж., Цуй К., Чен С., Рен Дж., Чен Дж., Гао Ю., Ли Х., Цзя Н., Ченг Л., Сяо Х. и др. (2009). Создание индуцированных линий плюрипотентных стволовых клеток из клеток взрослых крыс. Cell Stem Cell 4, 11–15 [PubMed] [Google Scholar]
  • Ueda S., Kawamata M., Teratani T., Shimizu T., Tamai Y., Ogawa H., Hayashi K., Tsuda H., Ochiya Т. (2008). Создание эмбриональных стволовых клеток крысы и создание крыс-химер. PLoS ONE 3, e2800. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Ян X.Z., Han M.S., Нива К., Ианнакконе П.М. (2004). Факторы, необходимые во время предварительного культивирования ооцитов крыс вскоре после проникновения сперматозоидов для стимулирования их дальнейшего развития в среде с определенным химическим составом. J. Reprod. Dev. 50, 533–540 [PubMed] [Google Scholar]
  • Zan Y., Haag JD, Chen KS, Shepel LA, Wigington D., Wang YR, Hu R., Lopez-Guajardo CC, Brose HL, Porter KI, et al. al. (2003). Получение нокаутных крыс с использованием мутагенеза ENU и дрожжевого скринингового анализа. Nat Biotechnol. 21, 645–651 [PubMed] [Google Scholar]
  • Zhou Y., Галат В., Гартон Р., Таборн Г., Нива К., Ианнакконе П. (2003). Двухфазная химически определенная система культивирования для преимплантационных эмбрионов крыс. Бытие 36, 129–133 [PubMed] [Google Scholar]

Мыши в мире биологии стволовых клеток

Nat Genet. Авторская рукопись; доступно в PMC 2008 30 мая.

Опубликован в окончательной редакции как:

PMCID: PMC2405927

NIHMSID: NIHMS44874

Медицинский институт Говарда Хьюза, Университет Рокфеллера, Лаборатория клеточной биологии и развития млекопитающих Йорк, 1230 Box 300, Нью-Йорк, Нью-Йорк 10021, США.

Окончательная отредактированная версия этой статьи издателем доступна на сайте Nat Genet. См. Другие статьи в PMC, в которых цитируется опубликованная статья.

Abstract

Способность эмбрионов к разнообразию и некоторых взрослых тканей к регенерации на протяжении всей жизни напрямую связана со стволовыми клетками. Эти клетки обладают способностью к самообновлению, то есть к делению и созданию дополнительных стволовых клеток, а также к дифференцировке по определенной линии. Дифференциация плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток по определенным клеточным линиям используется для понимания молекулярных механизмов, участвующих в развитии тканей.Часто безграничная способность эмбриональных стволовых клеток генерировать дифференцированные типы клеток позиционирует область стволовых клеток на стыке между биологами развития, которые очарованы свойствами этих клеток, и клиницистами, которые воодушевлены перспективами получения стволовых клеток из скамейка у постели больного для лечения дегенеративных заболеваний и травм, от которых в настоящее время нет лекарств. Здесь мы подчеркиваем важность мышей в биологии стволовых клеток и в том, чтобы сделать мир еще на шаг ближе к тому, чтобы увидеть, как эти клетки воплощаются в жизнь в современной медицине.

Эмбриональные стволовые клетки как источник для заместительной клеточной терапии

Эмбриональные стволовые клетки мыши (ESC) были впервые выделены с помощью in vitro культуры клеток, выделенных из внутренней клеточной массы (ICM) ранних эмбрионов или бластоцист 1 , 2 (). В соответствующих условиях культивирования ESC могут пролиферировать бесконечно долго, сохраняя при этом способность дифференцироваться во все типы соматических клеток (). Когда культивируемые ESC вводятся в ICM эмбрионов мыши, которые затем переносятся в маточный проток приемной матери-мыши, полученное потомство имеет химерные ткани и органы, состоящие из клеток, которые происходят частично из ESC, а частично из ICM.Поскольку происходящие из ESC половые клетки также присутствуют у химерных мышей-основателей, это мощный подход для внесения специфических генетических изменений в зародышевую линию мыши 3 .

Хронология основных открытий в исследовании стволовых клеток мышей. Показаны многие важные открытия, сделанные за последние 50 лет, когда исследователи использовали мышей в качестве модельных систем для создания основ биологии стволовых клеток. Эта работа имела фундаментальное значение для внедрения исследований стволовых клеток в клинические условия.LT-HSC, долгосрочные HSC; SCID-Hu, тяжелый комбинированный иммунодефицит человека.

Coaxing ESCs down отборные линии для терапевтического применения при травмах и дегенеративных расстройствах. Зиготы и их ранние клеточные деления вплоть до стадии морулы определяются как тотипотентные, потому что они могут генерировать целую мышь. На стадии бластоцисты только клетки ICM сохраняют способность генерировать все три первичных зародышевых листка (эктодерма, мезодерма и энтодерма), которые развиваются в органы и ткани тела.ESCs, культивируемые из ICM бластоцисты, можно дифференцировать in vitro и как эмбриоидные тельца. При правильном сочетании факторов роста эти эмбриоидные тела могут дифференцироваться в различные типы клеток. Полученные дифференцированные клетки мыши, полученные из ESC, были использованы в экспериментах по трансплантации на моделях грызунов при травмах и дегенеративных нарушениях. BMP4, костный морфогенетический белок 4; Db-CAMP, дибутирилциклический AMP; EGF, фактор роста эпидермиса; ЭПО, эритропоэтин; FGF2, фактор роста фибробластов 2; ИЛ, интерлейкин; M-CSF, колониестимулирующий фактор макрофагов; PDGF, фактор роста тромбоцитов; РА, ретиноевая кислота; Т3, трийодтиронин.

В нынешнюю эпоху «регенеративной медицины» ученые сейчас сосредоточены на оптимизации условий культивирования, необходимых для того, чтобы заставить культивируемые ЭСК дифференцироваться в определенные типы клеток, такие как сердечные, нервные или эндокринные клоны (). Если желаемый тип клеток может быть произведен в массовом порядке как чистая популяция in vitro , клетки можно протестировать на их способность к репопуляции и восстановлению поврежденных или дегенерирующих тканей. Новые результаты, полученные на мышиных моделях с использованием клоноспецифичных клеток, полученных из ESC, являются многообещающими и предполагают, что заместительная терапия на основе ESC может быть применима для лечения дегенеративных заболеваний человека, связанных с потерей или уменьшением пула определенного типа клеток.

Потенциал терапии стволовыми клетками распространяется на многие заболевания, включая инфаркт миокарда 4 , болезнь Паркинсона 5 , болезнь миелина 6 и печеночную недостаточность 7 (). Многие исследования на мышах, включающие регенеративную терапию с использованием клеток, полученных из ESC, находятся на предварительной стадии, и в большинстве случаев возможность долгосрочного выживания мышей или осложняющих побочных эффектов подробно не анализировалась. Но достигнутые к настоящему времени успехи вдохновляют и предполагают, что технологии, относящиеся к регенеративной терапии на основе ESC, могут быть полезны в клинических условиях.

Перенос ядра соматических клеток

Одной из самых серьезных проблем в использовании клинического потенциала ЭСК является устранение иммунологических барьеров для трансплантации тканей, полученных из ЭСК человека. Использование геномной замены, известной как перенос ядра соматической клетки, предлагает возможное решение иммунного отторжения тканеспецифичных популяций клеток, полученных в результате дифференцировки чужеродных ЭСК. Репрограммированная терапия соматических клеток, называемая терапевтическим клонированием, использует эту технологию для введения ядра взрослой донорской клетки ( e.грамм. , лимфоцита B или T 8 ) в энуклеированный ESC хозяина для создания гибридной линии ESC. Теперь адаптированная для генетического соответствия донору, эта линия ESC может быть дифференцирована в выбранный тип клеток и использована в регенеративной трансплантации для лечения пораженного человека. Одна из проблем заключается в том, что митохондриальный геном по-прежнему будет происходить из исходной линии ESC, и поэтому «чужие» митохондриальные белки будут производиться этими клетками. Исследования на мышах будут полезны для более подробного изучения того, в какой степени эти чужеродные белки могут вызывать иммунную реакцию.Такие исследования станут предпосылкой для применения этой технологии в медицине.

Если отбросить эти оговорки, насколько хорошо работает технология передачи ядер? До сих пор большинство исследований было сосредоточено на переносе ядер от соматических клеток в яйца мыши. Этот метод производит гибридные ESC, называемые ESC с переносом ядра (ntESC), которые затем вводятся в ICM бластоцисты хозяина для создания «клонированной» мыши, а не используются для дифференциации и регенеративной терапии. Клонированные мыши были созданы с помощью этого подхода, что указывает на то, что необходимые технические манипуляции могут быть выполнены без нарушения способности ntESC генерировать все ткани и органы мыши 9 .Что до сих пор модели мышей говорили нам об обещаниях и подводных камнях?

В особенно творческом примере Rideout et al. 10 сочетали терапевтическое клонирование с генной терапией для исправления генетического дефекта в иммунной системе (). В этом подходе перенос ядра был впервые использован для создания ntESC, несущих мутацию в гене, кодирующем рекомбиназу Rag2, который необходим для развития B- и T-клеток. Затем гомологичная рекомбинация была использована для исправления дефекта в Rag2 в культивируемых ntESC.После их восстановления ntESC были использованы для создания мышей, которые показали полное восстановление иммунной функции. Возможно, даже более важным для терапевтического клонирования является то, что репарированные ESC дифференцировались в культуре с образованием гемопоэтических стволовых клеток (HSC), которые затем, как было показано, спасали, по крайней мере частично, облученных Rag2 - / - мышей 10 . Эта работа представляет собой доказательство принципа использования терапии ядерным переносом соматических клеток для лечения генетического заболевания. Неожиданно, однако, первоначальные попытки приживления этих клеток потерпели неудачу из-за увеличения естественных клеток-киллеров.В этом отношении более многообещающие результаты были получены с дифференцировкой ntESCs в определенный тип клеток, который не имеет множества вариантов, переданных стволовым клеткам, включая HSCs. Например, трансплантация дофаминергических нейронов, происходящих из ntESC, по-видимому, корректирует фенотип мышиной модели болезни Паркинсона 11 .

Генная терапия в сочетании с терапевтическим клонированием. Схема эксперимента Rideout et al. 10 , которые использовали технологию ESC и генную терапию для исправления генетических дефектов в системе кроветворения.Клеточные культуры сначала получают из кончиков хвостов иммунодефицитных мышей, гомозиготных по нокаутной мутации в Rag2 . Затем ядра из этих клеток переносятся в энуклеированные ооциты, выделенные от нормальной мыши. Полученные гибридные клетки культивируют и вводят в ICM бластоцист мыши для получения Rag2 - / - ESC или ntESC. Генетическая мутация Rag2 затем корректируется путем гомологичной рекомбинации, и манипулируемые ntESC дифференцируются in vitro сначала в эмбриоидные тельца (EB), а затем в гемопоэтические клетки-предшественники, которые впоследствии повторно вводятся в исходный Rag2 - / - мышей, чтобы вылечить их.

В будущем будет важно производить плюрипотентные ntESCs из ядер людей, пораженных различными генетическими нарушениями человека, и использовать эти плюрипотентные линии для изучения развития и патогенеза этих заболеваний in vitro . Одиннадцать человеческих линий ESC были недавно созданы путем ядерного переноса клеток кожи, полученных от людей с заболеванием или травмой, в донорские ооциты 12 . Кроме того, недавние исследования показывают, что человеческие ESCs, слитые с соматическими фибробластами, могут репрограммировать ядра фибробластов и делать клетки плюрипотентными 13 .

Взрослые стволовые клетки от скамейки к постели

Большинство, если не все, взрослые ткани служат резервуарами стволовых клеток для восполнения клеток, которые теряются в результате повреждения ткани или гомеостаза. Каждый раз, когда образуется легкая рана, взрослые стволовые клетки (ASC) вступают в действие: стволовые клетки волосяного фолликула восстанавливают поврежденный эпидермис и волосяные фолликулы, а HSC восполняют потерянную кровь. ASC используются редко и обычно спрятаны в защищенных нишах, где они существуют в виде неподвижных, недифференцированных и недостаточно представленных компонентов ткани 14 .Выделение и характеристика ASCs создают проблемы не только из-за их статуса меньшинства, но также из-за нехватки определения маркеров клеточной поверхности.

Первыми мультипотентными ASC, которые были очищены и охарактеризованы, были HSC, расположенные в костном мозге мышей 15 . Эти ASC могут восстанавливать гематолимфоидную систему смертельно облученных мышей 16 . Присутствие HSC в костном мозге мышей и людей позволило использовать трансплантаты костного мозга в качестве терапии для лечения людей с апластической анемией, лейкемиями 17 , солидными опухолями, иммунодефицитом и нарушениями гемоглобина.

В последующие годы другие кандидаты ASC были определены только временно по их анатомическим характеристикам и свойствам медленного цикла. Эти кандидаты включают мышечные сателлитные клетки, которые присутствуют под базальной пластинкой зрелых мышечных волокон 18 ; эпителиальные стволовые клетки кожи, которые находятся под сальной железой в волосяном фолликуле в области, известной как «выпуклость» 19 ; стволовые клетки кишечника, расположенные у основания крипт кишечника 20 ; сердечные стволовые клетки 21 , 22 ; стволовые клетки нервного гребня 23 , 24 ; и бронхоальвеолярные стволовые клетки в легком 25 .

ASC обеспечивают возможность коррекции дефектных тканей и органов с помощью аутологичных методов лечения, которые устраняют риск отторжения трансплантата. Подобно стратегиям, основанным на ESC, описанным выше, существует множество моделей заболевания на мышах, показывающих, что после ex vivo генетической модификации аутологичные HSCs могут восстанавливать специфический дефект в гемопоэтическом клоне. Такие исследования сыграли важную роль в разработке и совершенствовании методов лечения различных гематологических заболеваний человека, включая рак ().

Другим вариантом лечения некоторых заболеваний является введение и экспрессия рекомбинантных генов в соматических клетках (, т.е. , генная терапия) с использованием вирусных и невирусных векторов. Среди самых продолжительных и широко освещаемых исследований - исследования, направленные на детей, страдающих тяжелыми комбинированными иммунодефицитами, в которых задерживается дифференцировка Т-клеток 26 . Существует десять генетически различных типов тяжелого комбинированного иммунодефицита, каждый из которых приводит к преждевременной смерти при отсутствии терапии.Предварительные результаты генной терапии с использованием аллогенных HSC казались очень многообещающими, потому что многие люди ответили хорошо. Однако впоследствии у 3 человек из исследования, в котором участвовало около 13 человек, развился Т-клеточный лейкоз. Главный риск, связанный с опосредованным ретровирусом переносом гена, - это случайное внедрение ретровируса в протоонкогены генома. Действительно, лейкозные клетки, выделенные от пораженных людей, содержали вирусную вставку рядом с онкогеном, который, как известно, активируется хромосомной транслокацией 27 .

Одновременно с разработкой HSC для лечения иммунодефицитных расстройств появились эпидермальные стволовые клетки для лечения пациентов с тяжелыми ожогами 28 . В исследованиях, предшествовавших испытаниям на людях, мышей с ослабленным иммунитетом использовали в качестве заменителей культивированных трансплантатов эпидермальных клеток, которые производили и поддерживали здоровый участок эпидермиса человека. Хотя кожа, полученная из культивированных эпидермальных трансплантатов, не потеет и не образует волос, она спасает жизни людей с ожогами и до сих пор используется во многих странах.

После почти двух десятилетий дальнейших обширных исследований на мышах исследователи недавно разработали методы выделения и характеристики мультипотентных стволовых клеток из волосяного фолликула 29 - 31 . Одна из стратегий заключалась в выделении стволовых клеток на основе их характеристик медленного цикла и их экспрессии флуоресцентно меченного трансгена 31 . Чтобы создать универсальную модель для выделения редко циклических клеток, была сконструирована трансгенная мышь, в которой экспрессия гистона h3B, меченного зеленым флуоресцентным белком (GFP), находится под контролем регулирующего элемента, реагирующего на тетрациклин (TRE).Эта мышь может быть скрещена с любой трансгенной мышью, экспрессирующей TRE-связывающий репрессор транскрипции (отключенный тетрациклин) под контролем промотора, специфичного для любого типа клеток. Для тестирования модели промотор кератина-5 использовался для нацеливания выключенного тетрациклина на кератиноциты кожи и других многослойных эпителиальных тканей 31 . При введении доксициклина мышам с пищей экспрессия h3B-GFP была отключена, так что через 4–8 недель только редко повторяющиеся стволовые клетки сохраняли метку.Затем для выделения стволовых клеток использовали сортировку клеток, активируемую флуоресценцией.

В ситуациях, когда мало что известно об ASC ткани и, в частности, когда не были идентифицированы диагностические маркеры клеточной поверхности, модель TRE-h3B-GFP может быть полезна, если подходящий промотор для отключения тетрациклина доступный. Идентификация, очистка и мониторинг клеток с медленным циклом, сохраняющих метку, позволят исследовать степень, в которой клетки могут быть стволовыми.В экспериментах по приживлению кератиноцитов, культивируемых из одной стволовой клетки фолликула, могут образовываться участки флуоресцентного эпидермиса, сальных желез и волос на бестимусных мышах, в остальном голых 29 . Хотя еще слишком рано судить о том, будет ли технология восстановления волос на спине голой мыши превратиться в клиническое лечение заболеваний человеческого волоса, способность определять профиль транскрипции этих клеток открывает путь к выяснению механизмов путем эпителиальные стволовые клетки кожи могут реагировать на внешние сигналы, чтобы вызвать новый виток роста волос.

Успехи в переводе ASC в клинику активизировали поиск ASC в других тканях. Этот интерес был частично вызван этическими противоречиями вокруг потенциального использования ESC в терапии заболеваний человека. Однако, когда дело доходит до лечения заболевания определенного типа клеток, соответствующий ASC может быть полезен из-за его более ограниченного потенциала, при условии, что его можно культивировать in vitro, и уговорить следовать определенной линии.Хотя очень немногие ASC были успешно размножены in vitro , доступность транскрипционных профилей многих ASC определила их репертуар рецепторов клеточной поверхности, что может помочь улучшить условия культивирования в будущем.

Какие еще ASC находятся на горизонте? Мультипотентные клетки нервной ткани из головного мозга взрослой мыши были очищены и могут делиться и давать как нейроны, так и глиальные клетки в культуре 24 , 32 .Кроме того, трансплантация обогащенных нервных популяций показала клиническую полезность при лечении одноклеточных неврологических расстройств, таких как болезнь Паркинсона, которая вызывается деградацией дофаминергических нейронов в полосатом теле 33 . Однако выживаемость привитых дофаминергических нейронов, полученных из расширенного предшественника, низкая (3–5%), что указывает на необходимость повышения выживаемости клеток после трансплантации.

Поджелудочная железа показывает ограниченный клеточный оборот, и был предложен эндогенный источник стволовых клеток для регенерации инсулин-секретирующих клеток поджелудочной железы 34 .Поджелудочная железа содержит островки, секретирующие инсулин, которые регулируют уровень глюкозы у человека и разрушаются аутоиммунной атакой при диабете 1 типа. Поскольку пополнение популяций β-клеток поджелудочной железы сопровождается секрецией эндогенного инсулина, выделение стволовых клеток поджелудочной железы, которые могут продуцировать новые β-клетки, может привести к излечению от диабета 1 типа. Однако недавняя работа показывает на мышах, что уже существующие β-клетки, а не мультипотентные стволовые клетки, являются основным источником новых β-клеток во взрослой жизни и после панкреатэктомии 35 .Эта работа предполагает, что дифференцированные клетки ткани могут сохранять пролиферативную способность in vivo.

Скелетные мышцы представляют собой интересный пример для биологов, которые традиционно ищут стволовые клетки в определенной нише или резервуаре. Митотически покоящиеся миогенные предшественники называются сателлитными стволовыми клетками. Несмотря на то, что сателлитные стволовые клетки привлекли к себе большое внимание при лечении людей, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна, функциональные свойства этих мышечных стволовых клеток остаются неясными.Клональная популяция мышечных клеток-предшественников была идентифицирована и после внутримышечной или внутривенной инъекции приводит к регенерации мышц и частичному восстановлению дистрофина у мышей mdx , модели мышечной дистрофии Дюшенна 36 . После внутриартериальной инъекции изолированные мышечные предшественники, по-видимому, приживают дистрофические мышцы мышей и участвуют в регенерации после повреждения мышц 37 , 38 . Остается неясным, представляют ли какие-либо из этих культивируемых клеток чистый пул стволовых клеток; тем не менее, линии миогенных клеток могут быть полезны в качестве источника миогенных предшественников для прямой или системной трансплантации.

Анализ свойств предполагаемых генов стволовых клеток

С появлением технологии массивов генов молекулярная характеристика стволовых клеток сделала шаг вперед, предоставив исчерпывающие снимки транскрипционных профилей этих клеток. Этот прогресс побудил исследователей обратиться к некоторым фундаментальным вопросам биологии стволовых клеток. Являются ли определенные особенности общими для всех стволовых клеток? Чем ASC отличаются от ESC? Какие молекулярные механизмы контролируют состояние покоя стволовых клеток и их способность к самообновлению? И как стволовые клетки активируются при их превращении из неподвижной мультипотентной клетки в коммитированную клетку, которая временно делится и дифференцируется по определенному клону?

Две основные проблемы стоят перед исследователями, пытающимися использовать транскрипционный репертуар мультипотентных стволовых клеток.Первый - это разработка стратегий выделения и очистки этих второстепенных компонентов ткани; второй - выбор того, с чем сравнивать эти ячейки. В ранних исследованиях такого рода Иванова и соавт. 39 использовали маркеры клеточной поверхности и клеточную сортировку, активируемую флуоресценцией, для выделения и определения профиля транскрипции HSC и их ранних коммитированных транзиентных потомков амплификации. Рамальо-Сантос и др. 40 использовали аналогичные методы для выделения HSC, но сравнили их профили транскрипции с профилями цельного костного мозга.Несмотря на воспроизводимые данные массива для HSC, список того, что составляет «стволовость» HSC, заметно отличался в двух исследованиях. Одна группа определила гены, которые были активированы в HSC по сравнению со всей гетерогенной тканью, окружающей клетки, тогда как другая определила гены, экспрессия которых изменилась, поскольку HSCs изменили свои свойства и вступили в клон. Оба типа сравнения полезны, но они дают очень разную информацию.

Поскольку все больше стволовых клеток и их потомков выделяются и профилируются, подробные данные об экспрессии накапливаются с большой скоростью.Ученые начали пожинать плоды этих молекулярных сигнатур, более глубоко исследуя механизмы, с помощью которых стволовые клетки поддерживаются в их нишах в состоянии покоя и дифференцировки, и как они становятся мобилизованными, когда они покидают свои ниши и выбирают определенную линию.

Многие примеры показывают, как молекулярные маркеры, иногда в сочетании с моделями трансгенных и нокаутных мышей, дают представление о механизмах, лежащих в основе поддержания и самообновления стволовых клеток.Hoxb4, например, представляет собой фактор транскрипции, содержащий гомеодомен, который обнаружен в нескольких различных массивах. Hoxb4 увеличивает жизнеспособность и пролиферацию при сверхэкспрессии в мышиных HSC 41 , что, в свою очередь, дает повышенную эффективность спасения при трансплантации мышам с истощенными HSC. Другим примером является Bmi-1, член регулирующего хроматин комплекса Polycomb, который необходим для генерации самообновляющихся взрослых HSCs 42 и для самообновления нервных стволовых клеток 43 .

Не менее важны, чем факторы ремоделирования хроматина, в управлении стволовыми клетками пути передачи сигнала. Передача сигналов Wnt стала универсальным регулятором стволовых клеток, но то, как именно Wnts действуют на стволовые клетки, остается предметом интенсивных дискуссий 44 . Клетки отвечают на каноническую передачу сигналов Wnt, стабилизируя избыток β-катенина, который не используется в клеточной адгезии. Этот стабилизированный β-катенин затем может свободно связываться и действовать как транскрипционный кофактор для членов семейства ДНК-связывающих белков Lef1 или Tcf.Трансгенная сверхэкспрессия конститутивно стабилизированной версии β-catenin в эпидермисе кожи приводит к морфогенезу de novo волосяных фолликулов, что характерно для мультипотентных эмбриональных стволовых клеток кожи, но не для эпидермиса взрослых 45 . Немного более низкие уровни передачи сигналов Wnt приводят к активации ASC существующих волосяных фолликулов 46 . Напротив, мутации с потерей функции в β-catenin полностью блокируют образование волосяных фолликулов 47 . В кишечнике потеря партнера β-катенина Tcf4 блокирует образование ткани 48 .

В нервной системе трансгенная сверхэкспрессия β-катенина приводит к увеличению мозга и увеличению популяции предшественников 49 , тогда как в стволовых клетках нервного гребня стабилизированный β-катенин мало влияет на размер популяции и вместо этого регулирует решения судьбы 50 . В предшественниках костного мозга инактивация β-catenin in vivo , по-видимому, не нарушает способность этих клеток к самообновлению и воссозданию гематопоэтических клонов 51 .Но сверхэкспрессия β-катенина в культивируемых потомках изолированных HSC способствует пролиферации этих клеток, которые при введении в кровь смертельно облученных мышей, по крайней мере, поддерживают продукцию миелоидных, B- и T-клеточных линий 52 .

В то время как исследователи изучают механизмы, лежащие в основе передачи сигналов Wnt в биологии стволовых клеток, они также изучают, как другие пути могут действовать согласованно, чтобы интегрировать биологию стволовых клеток. Подобно передаче сигналов Wnt, передача сигналов Notch и костных морфогенетических белков, по-видимому, оказывает плейотропные эффекты на стволовые клетки и их клоны, и эти эффекты, по-видимому, различаются для разных стволовых клеток 53 .Остается неясным, действуют ли эти факторы на уровне самообновления стволовых клеток, активации стволовых клеток или кратковременной амплифицирующей пролиферации или дифференцировки клеток. Напр., Нарушение ткани, наблюдаемое в моделях нокаута мышей, может возникать либо из-за дефекта стволовых клеток, либо из-за неспособности пролиферировать потомство временных амплифицирующих клеток. Точно так же влияние сигнального фактора на пролиферацию культивируемых стволовых клеток может быть либо признаком повышенной пролиферации потомства временных амплифицирующих клеток в культуре, либо признаком самообновления стволовых клеток.По мере проведения будущих исследований должно стать очевидным, поддерживаются и размножаются ли стволовые клетки с помощью общего набора регуляторных путей и молекулярных принципов, или кажущееся противоположное влияние сигнальных молекул на поведение различных клеток является отражением разнообразия. ИСК.

Стволовые клетки дома

В тканях взрослых мультипотентные стволовые клетки часто спрятаны в защищенных местах или нишах. Самая защищенная ниша - это костный мозг, в котором находятся ГСК.Кожу можно микродиссектировать на единицы, в которых каждый волосяной фолликул имеет крошечную нишу (выпуклость) стволовых клеток, которые отвечают за образование новых волос во время цикла роста волос и за пополнение клеток сальной железы и эпидермиса при травмах. 54 . Точно так же кишечник состоит из сотен единиц, каждая из которых содержит ворсинки и крипту, а стволовые клетки расположены кольцом прямо над основанием крипты. Стволовые клетки в каждой крипте ответственны за создание четырех линий абсорбционных и секреторных клеток, которые составляют крипту и ворсинку 20 .В центральной нервной системе взрослого человека стволовые клетки расположены в субвентрикулярной зоне, где они могут генерировать глию и нейроны 24 .

Важность ниши лучше всего иллюстрируется экспериментами, в которых судьба ESCs отслеживается после их подкожной инъекции иммунодефицитным голым мышам. При помещении в инородную среду окружающей in vivo ткани, ESC образуют доброкачественные тератомы, которые содержат множество типов клеток 55 .Это исследование показывает важность соответствующей микросреды для конкретных межклеточных взаимодействий и клеточной организации.

Большинство стволовых клеток совершают дифференцировку по определенным линиям, когда они покидают свою нишу. ГСК кажутся исключением, потому что они могут циркулировать в кровотоке и возвращаться домой относительно невредимыми в процессе, называемом наведением 56 . Эксперименты с использованием генетически маркированных мышей с парабиотиками CD45.1 и CD45.2, которые имеют общую циркуляцию, были проведены для изучения миграции HSC из костного мозга через кровь 57 .Результаты показывают, что HSC, обнаруживаемые в периферической крови, мигрировали из своей ниши, что приводит к возможности того, что HSC, передаваемые через кровь, могут быть источником плюрипотентных или мультипотентных стволовых клеток, доступных для восстановления как негематопоэтических, так и гематопоэтических тканей 57 .

Поскольку стволовые клетки зависят от окружающей среды для поддержания своих свойств стволовых клеток, развитие ниши имеет решающее значение 14 . Внутри ниши стволовые клетки обычно поддерживают среду, препятствующую росту и дифференцировке.Каждый раз, когда стволовой клетке предлагается покинуть нишу, ее необходимо пополнять, предположительно путем самообновления. И наоборот, чтобы стволовая клетка покинула нишу и последовала определенному клону, ее микросреда должна измениться, накапливать или утратить важные факторы, которые в противном случае удерживают ее в ее нише.

Генетические исследования половых клеток Drosophila melanogaster дают лучшее представление о том, как это изменение могло произойти. 58 . Хотя исследования ниш млекопитающих отстают, недавняя характеристика и генетические манипуляции с мышиными ASC и их нишами привели к прогрессу в нашем понимании того, что составляет эту среду в биологии стволовых клеток млекопитающих.Такие исследования также дали представление о том, как ключевые сигнальные пути регулируют поведение стволовых клеток.

Среди наиболее интересных достижений в этой области - исследования глубины ниши костного мозга HSC, выстланной пространственно ориентированными остеобластами. По мере того, как HSC прогрессивно созревают, они теряют контакт с этими соседними стромальными клетками, становятся более пролиферативными, направляются в центральную полость костного мозга и проникают в кровеносные сосуды. Когда мышей генетически изменяют для увеличения популяции остеобластов на внутренней поверхности кости, количество HSC одновременно увеличивается, и способность этих новых HSC сохранять свои свойства медленного цикла, по-видимому, зависит от их способности напрямую прикрепляться к остеобластам через N-кадгерин. –Опосредованные спаечные соединения 59 .Эти исследования выявили решающую роль остеобластов в поддержании долгоживущих и наиболее ценных HSC. Данные также показывают, что по крайней мере некоторые HSC контактируют с синусоидальным эндотелием кровеносных сосудов в костном мозге, что может объяснить, почему HSC могут быть мобилизованы в кровоток с очень быстрой кинетикой 60 . Примечательно, что недавно было показано, что эмбриональные стволовые клетки кожи используют адгезивные соединения для контроля асимметричного деления клеток, что может иметь широкое значение для стволовых клеток 61 .

В заключение следует отметить, что характеристика стволовых клеток мышей и манипуляции с ними привели к широкому спектру клинических применений и многообещающим направлениям для будущих исследований. Внедряя эту мощную технологию из области моделей мышей в клинические условия, ученым всего мира необходимо будет разработать руководящие принципы, которые сбалансируют моральные и этические соображения с пользой для терапевтической медицины. При этом ответственность за эффективное общение и убеждение общественности в важности продвижения вперед лежит на ученых.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарим M. Schober, V. Horsley и C. Blanpain за обсуждения и советы во время подготовки этого обзора. Г.Г. является получателем программы Human Frontier Science Programme. E.F. - исследователь Медицинского института Говарда Хьюза и получатель финансирования от Национальных институтов здравоохранения США.

Ссылки

1. Evans MJ, Kaufman MH. Создание в культуре плюрипотенциальных клеток из эмбрионов мыши. Природа. 1981; 292: 154–156. [PubMed] [Google Scholar] 2.Мартин ГР. Выделение линии плюрипотентных клеток из ранних эмбрионов мыши, культивированных в среде, кондиционированной стволовыми клетками тератокарциномы. Proc. Natl. Акад. Sci. США. 1981; 78: 7634–7638. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 3. Брэдли А., Эванс М., Кауфман М. Х., Робертсон Э. Формирование химер зародышевой линии из клеточных линий тератокарциномы, полученных из эмбрионов. Природа. 1984. 309: 255–256. [PubMed] [Google Scholar] 4. Клуг MG, Soonpaa MH, Koh GY, Field LJ. Генетически отобранные кардиомиоциты из дифференцирующихся эмбриональных стволовых клеток образуют стабильные внутрисердечные трансплантаты.J. Clin. Вкладывать деньги. 1996. 98: 216–224. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 5. Ким Дж. Х. и др. Дофаминовые нейроны, полученные из эмбриональных стволовых клеток, функционируют в животной модели болезни Паркинсона. Природа. 2002; 418: 50–56. [PubMed] [Google Scholar] 6. Brustle O и др. Глиальные предшественники, полученные из эмбриональных стволовых клеток: источник миелинизирующих трансплантатов. Наука. 1999. 285: 754–756. [PubMed] [Google Scholar] 7. Chinzei R, et al. Клетки эмбриональных тельцов, полученные из линии эмбриональных стволовых клеток мыши, дифференцируются в функциональные гепатоциты.Гепатология. 2002; 36: 22–29. [PubMed] [Google Scholar] 8. Hochedlinger K, Jaenisch R. Моноклональные мыши, полученные путем переноса ядра из зрелых B- и T-донорных клеток. Природа. 2002; 415: 1035–1038. [PubMed] [Google Scholar] 9. Вакаяма Т. и др. Дифференциация линий эмбриональных стволовых клеток, полученных из взрослых соматических клеток путем переноса ядра. Наука. 2001; 292: 740–743. [PubMed] [Google Scholar] 10. Rideout WM, III, Hochedlinger K, Kyba M, Daley GQ, Jaenisch R. Исправление генетического дефекта с помощью ядерной трансплантации и комбинированной клеточной и генной терапии.Клетка. 2002; 109: 17–27. [PubMed] [Google Scholar] 11. Барбери Т. и др. Спецификация нейронного подтипа эмбриональных стволовых клеток при оплодотворении и переносе ядра и применение у мышей с паркинсонизмом. Nat. Biotechnol. 2003. 21: 1200–1207. [PubMed] [Google Scholar] 12. Hwang WS и др. Эмбриональные стволовые клетки, специфичные для пациента, полученные из бластоцист SCNT человека. Наука. 2005; 308: 1777–1783. [PubMed] [Google Scholar] 13. Cowan CA, Atienza J, Melton DA, Eggan K. Ядерное перепрограммирование соматических клеток после слияния с человеческими эмбриональными стволовыми клетками.Наука. 2005; 309: 1369–1373. [PubMed] [Google Scholar] 14. Фукс Э., Тумбар Т., Гуаш Г. Общение с соседями: стволовые клетки и их ниша. Клетка. 2004. 116: 769–778. [PubMed] [Google Scholar] 15. Spangrude GJ, Heimfeld S, Weissman IL. Очистка и характеристика гемопоэтических стволовых клеток мыши. Наука. 1988. 241: 58–62. [PubMed] [Google Scholar] 16. Ford CE, Hamerton JL, Barnes DW, Loutit JF. Цитологическая идентификация радиационных химер. Природа. 1956; 177: 452–454. [PubMed] [Google Scholar] 17.Бакнер CD и др. Аллогенное приживление костного мозга после облучения всего тела у пациента с лейкемией. Кровь. 1970; 35: 741–750. [PubMed] [Google Scholar] 18. Сил П., Асакура А., Рудницкий М.А. Потенциал мышечных стволовых клеток. Dev. Клетка. 2001; 1: 333–342. [PubMed] [Google Scholar] 19. Cotsarelis G, Sun TT, Lavker RM. Клетки, сохраняющие метку, находятся в области выпуклости волосистой части тела: это влияет на фолликулярные стволовые клетки, цикл роста волос и канцерогенез кожи. Клетка. 1990; 61: 1329–1337. [PubMed] [Google Scholar] 20.Loeffler M, Birke A, Winton D, Potten C. Соматические мутации, моноклональность и стохастические модели организации стволовых клеток в кишечном крипте. J. Theor. Биол. 1993; 160: 471–491. [PubMed] [Google Scholar] 21. Бельтрами А.П. и др. Взрослые кардиальные стволовые клетки мультипотентны и поддерживают регенерацию миокарда. Клетка. 2003. 114: 763–776. [PubMed] [Google Scholar] 23. Buchstaller J, et al. Эффективное выделение и профилирование экспрессии генов небольшого количества стволовых клеток нервного гребня и развивающихся шванновских клеток.J. Neurosci. 2004. 24: 2357–2365. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 24. Doetsch F, Caille I, Lim DA, Garcia-Verdugo JM, Alvarez-Buylla A. Астроциты субвентрикулярной зоны представляют собой нервные стволовые клетки в мозге взрослых млекопитающих. Клетка. 1999; 97: 703–716. [PubMed] [Google Scholar] 25. Kim CF, et al. Идентификация бронхоальвеолярных стволовых клеток при нормальном раке легких и легких. Клетка. 2005; 121: 823–835. [PubMed] [Google Scholar] 26. Cavazzana-Calvo M, et al. Генная терапия тяжелого комбинированного иммунодефицита человека (SCID) -X1 болезни.Наука. 2000. 288: 669–672. [PubMed] [Google Scholar] 27. Hacein-Bey-Abina S, et al. LMO2-ассоциированная пролиферация клональных Т-клеток у двух пациентов после генной терапии SCID-X1. Наука. 2003. 302: 415–419. [PubMed] [Google Scholar] 28. Gallico GG, III, O'Connor NE, Compton CC, Kehinde O, Green H. Постоянное покрытие больших ожоговых ран аутологичным культивированным эпителием человека. N. Engl. J. Med. 1984; 311: 448–451. [PubMed] [Google Scholar] 29. Blanpain C, Lowry WE, Geoghegan A, Polak L, Fuchs E. Самообновление, мультипотентность и существование двух популяций клеток в нише эпителиальных стволовых клеток.Клетка. 2004. 118: 635–648. [PubMed] [Google Scholar] 30. Моррис Р.Дж. и др. Захват и профилирование стволовых клеток взрослых волосяных фолликулов. Nat. Biotechnol. 2004; 22: 411–417. [PubMed] [Google Scholar] 32. Rietze RL, et al. Очистка плюрипотентных нервных стволовых клеток из мозга взрослой мыши. Природа. 2001; 412: 736–739. [PubMed] [Google Scholar] 33. Studer L, Tabar V, McKay RD. Трансплантация расширенных предшественников мезэнцефалита приводит к выздоровлению крыс с паркинсонизмом. Nat. Neurosci. 1998; 1: 290–295. [PubMed] [Google Scholar] 34.Сиберг Р.М. и др. Клональная идентификация мультипотентных предшественников из поджелудочной железы взрослых мышей, которые генерируют нервные и панкреатические клоны. Nat. Biotechnol. 2004. 22: 1115–1124. [PubMed] [Google Scholar] 35. Дор Й, Браун Дж, Мартинес О.И., Мелтон Д.А. Взрослые β-клетки поджелудочной железы образуются путем самодублирования, а не дифференцировки стволовых клеток. Природа. 2004; 429: 41–46. [PubMed] [Google Scholar] 36. Ли JY и др. Клональная изоляция мышечных клеток, способных улучшить регенерацию мышц и заживление костей.J. Cell Biol. 2000; 150: 1085–1100. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 37. Torrente Y, et al. Внутриартериальная инъекция мышечных стволовых клеток CD34 + Sca-1 + восстанавливает дистрофин у мышей mdx . J. Cell Biol. 2001. 152: 335–348. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 38. Collins CA, et al. Функция стволовых клеток, самообновление и поведенческая неоднородность клеток из ниши взрослых мышечных сателлитных клеток. Клетка. 2005; 122: 289–301. [PubMed] [Google Scholar] 39.Иванова Н.Б., и др. Молекулярная сигнатура стволовых клеток. Наука. 2002; 298: 601–604. [PubMed] [Google Scholar] 40. Рамальо-Сантос М., Юн С., Мацузаки Ю., Маллиган Р.С., Мелтон Д.А. «Стебель»: профили транскрипции эмбриональных и взрослых стволовых клеток. Наука. 2002; 298: 597–600. [PubMed] [Google Scholar] 41. Антончук Дж., Соважо Дж., Хамфрис РК. HOXB4-индуцированная экспансия взрослых гемопоэтических стволовых клеток ex vivo . Клетка. 2002; 109: 39–45. [PubMed] [Google Scholar] 42. Парк И.К. и др. Bmi-1 необходим для поддержания самообновляющихся гемопоэтических стволовых клеток взрослых.Природа. 2003; 423: 302–305. [PubMed] [Google Scholar] 43. Молофский А.В., и др. Зависимость от Bmi-1 отличает самообновление нервных стволовых клеток от пролиферации предшественников. Природа. 2003; 425: 962–967. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 44. Клебер М., Соммер Л. Передача сигналов Wnt и регуляция функции стволовых клеток. Curr. Opin. Cell Biol. 2004. 16: 681–687. [PubMed] [Google Scholar] 45. Gat U, DasGupta R, Degenstein L, Fuchs E. De novo Морфогенез волосяного фолликула и опухоли волос у мышей, экспрессирующих усеченный β-катенин в коже.Клетка. 1998. 95: 605–614. [PubMed] [Google Scholar] 47. Huelsken J, Vogel R, Erdmann B, Cotsarelis G, Birchmeier W. β-Катенин контролирует морфогенез волосяного фолликула и дифференцировку стволовых клеток в коже. Клетка. 2001; 105: 533–545. [PubMed] [Google Scholar] 48. Коринек В. и др. Истощение компартментов эпителиальных стволовых клеток в тонком кишечнике мышей, лишенных Tcf-4. Nat. Genet. 1998. 19: 379–383. [PubMed] [Google Scholar] 49. Ченн А., Уолш, Калифорния. Регулирование размера коры головного мозга путем контроля выхода из клеточного цикла в нервных предшественниках.Наука. 2002. 297: 365–369. [PubMed] [Google Scholar] 50. Ли Х.Й. и др. Инструктивная роль Wnt / β-catenin в спецификации сенсорной судьбы в стволовых клетках нервного гребня. Наука. 2004. 303: 1020–1023. [PubMed] [Google Scholar] 52. Рейя Т. и др. Роль передачи сигналов Wnt в самообновлении гемопоэтических стволовых клеток. Природа. 2003; 423: 409–414. [PubMed] [Google Scholar] 53. Дункан А.В. и др. Интеграция передачи сигналов Notch и Wnt в поддержание гемопоэтических стволовых клеток. Nat. Иммунол. 2005. 6: 314–322. [PubMed] [Google Scholar] 54.Осима Х., Рочат А., Кедзия С., Кобаяши К., Баррандон Ю. Морфогенез и обновление волосяных фолликулов из взрослых мультипотентных стволовых клеток. Клетка. 2001; 104: 233–245. [PubMed] [Google Scholar] 55. Томсон Дж. А. и др. Линии эмбриональных стволовых клеток, полученные из бластоцист человека. Наука. 1998. 282: 1145–1147. [PubMed] [Google Scholar] 56. Quesenberry PJ, Colvin G, Abedi M. Перспектива: фундаментальные и клинические концепции самонаведения и приживления стволовых клеток: путешествие в ниши и за их пределы. Exp. Гематол. 2005; 33: 9–19.[PubMed] [Google Scholar] 57. Райт Д.Е., Уэйджерс А.Дж., Гулати А.П., Джонсон, Флорида, Вайсман, Иллинойс. Физиологическая миграция гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников. Наука. 2001; 294: 1933–1936. [PubMed] [Google Scholar] 58. Ямасита Ю.М., Фуллер М.Т., Джонс Д.Л. Передача сигналов в нишах стволовых клеток: уроки зародышевой линии Drosophila . J. Cell Sci. 2005. 118: 665–672. [PubMed] [Google Scholar] 59. Чжан Дж. И др. Идентификация ниши гемопоэтических стволовых клеток и контроль размера ниши. Природа. 2003; 425: 836–841.[PubMed] [Google Scholar] 60. Киль MJ и др. Рецепторы семейства SLAM различают гемопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники и выявляют эндотелиальные ниши для стволовых клеток. Клетка. 2005; 121: 1109–1121. [PubMed] [Google Scholar] 61. Lechler T, Fuchs E. Асимметричные деления клеток способствуют расслоению и дифференцировке кожи млекопитающих. Природа. 2005; 437: 275–280. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 62. Гудман Дж. В., Ходжсон Г. С.. Доказательства наличия стволовых клеток в периферической крови мышей. Кровь. 1962; 19: 702–714.[PubMed] [Google Scholar] 63. Flanagan SP. «Nude», новый ген безволосости с плейотропными эффектами у мышей. Genet. Res. 1966; 8: 295–309. [PubMed] [Google Scholar] 64. Харрисон DE. Конкурентная репопуляция: новый анализ долгосрочной функциональной способности стволовых клеток. Кровь. 1980; 55: 77–81. [PubMed] [Google Scholar] 65. Томас KR, Капеччи MR. Сайт-направленный мутагенез путем нацеливания на ген в стволовых клетках, полученных из эмбрионов мыши. Клетка. 1987. 51: 503–512. [PubMed] [Google Scholar] 66. МакКьюн Дж. М. и др. Мышь SCID-hu: мышиная модель для анализа дифференцировки и функции гематолимфоидов человека.Наука. 1988; 241: 1632–1639. [PubMed] [Google Scholar] 67. Томпсон С., Кларк А. Р., Пау А. М., Хупер М. Л., Мелтон Д. В.. Передача по зародышевой линии и экспрессия скорректированного гена HPRT, продуцируемого нацеливанием гена в эмбриональных стволовых клетках. Клетка. 1989; 56: 313–321. [PubMed] [Google Scholar] 68. Любин И. и др. Приживление и развитие человеческих Т- и В-клеток у мышей после трансплантации костного мозга. Наука. 1991; 252: 427–431. [PubMed] [Google Scholar] 69. Shinkai Y, et al. У мышей с дефицитом RAG-2 отсутствуют зрелые лимфоциты из-за неспособности инициировать перестройку V (D) J.Клетка. 1992. 68: 855–867. [PubMed] [Google Scholar] 70. Кэмпбелл К.Х., МакВир Дж., Ричи В.А., Уилмут И. Овцы, клонированные путем переноса ядра из культивируемой клеточной линии. Природа. 1996. 380: 64–66. [PubMed] [Google Scholar] 71. Томсон Дж. А. и др. Линии эмбриональных стволовых клеток, полученные из бластоцист человека. Наука. 1998. 282: 1145–1147. [PubMed] [Google Scholar] 72. Munsie MJ, et al. Выделение плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток из перепрограммированных ядер соматических клеток взрослых мышей. Curr. Биол. 2000; 10: 989–992. [PubMed] [Google Scholar] 73.Динсмор Дж. И др. Эмбриональные стволовые клетки дифференцировали in vitro и как новый источник клеток для трансплантации. Трансплантация клеток. 1996. 5: 131–143. [PubMed] [Google Scholar] 74. Ямамото Х. и др. Дифференциация эмбриональных стволовых клеток в гепатоциты: биологические функции и терапевтическое применение. Гепатология. 2003; 37: 983–993. [PubMed] [Google Scholar] 75. Мин JY и др. Трансплантация эмбриональных стволовых клеток улучшает сердечную функцию у постинфарктных крыс. J. Appl. Physiol. 2002. 92: 288–296.[PubMed] [Google Scholar]

мышей в мире биологии стволовых клеток

Nat Genet. Авторская рукопись; доступно в PMC 2008 30 мая.

Опубликован в окончательной редакции как:

PMCID: PMC2405927

NIHMSID: NIHMS44874

Медицинский институт Говарда Хьюза, Университет Рокфеллера, Лаборатория клеточной биологии и развития млекопитающих Йорк, 1230 Box 300, Нью-Йорк, Нью-Йорк 10021, США.

Окончательная отредактированная версия этой статьи издателем доступна на сайте Nat Genet. См. Другие статьи в PMC, в которых цитируется опубликованная статья.

Abstract

Способность эмбрионов к разнообразию и некоторых взрослых тканей к регенерации на протяжении всей жизни напрямую связана со стволовыми клетками. Эти клетки обладают способностью к самообновлению, то есть к делению и созданию дополнительных стволовых клеток, а также к дифференцировке по определенной линии. Дифференциация плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток по определенным клеточным линиям используется для понимания молекулярных механизмов, участвующих в развитии тканей. Часто безграничная способность эмбриональных стволовых клеток генерировать дифференцированные типы клеток позиционирует область стволовых клеток на стыке между биологами развития, которые очарованы свойствами этих клеток, и клиницистами, которые воодушевлены перспективами получения стволовых клеток из скамейка у постели больного для лечения дегенеративных заболеваний и травм, от которых в настоящее время нет лекарств.Здесь мы подчеркиваем важность мышей в биологии стволовых клеток и в том, чтобы сделать мир еще на шаг ближе к тому, чтобы увидеть, как эти клетки воплощаются в жизнь в современной медицине.

Эмбриональные стволовые клетки как источник для заместительной клеточной терапии

Эмбриональные стволовые клетки мыши (ESC) были впервые выделены с помощью in vitro культуры клеток, выделенных из внутренней клеточной массы (ICM) ранних эмбрионов или бластоцист 1 , 2 (). В соответствующих условиях культивирования ESC могут пролиферировать бесконечно долго, сохраняя при этом способность дифференцироваться во все типы соматических клеток ().Когда культивируемые ESC вводятся в ICM эмбрионов мыши, которые затем переносятся в маточный проток приемной матери-мыши, полученное потомство имеет химерные ткани и органы, состоящие из клеток, которые происходят частично из ESC, а частично из ICM. Поскольку происходящие из ESC половые клетки также присутствуют у химерных мышей-основателей, это мощный подход для внесения специфических генетических изменений в зародышевую линию мыши 3 .

Хронология основных открытий в исследовании стволовых клеток мышей.Показаны многие важные открытия, сделанные за последние 50 лет, когда исследователи использовали мышей в качестве модельных систем для создания основ биологии стволовых клеток. Эта работа имела фундаментальное значение для внедрения исследований стволовых клеток в клинические условия. LT-HSC, долгосрочные HSC; SCID-Hu, тяжелый комбинированный иммунодефицит человека.

Coaxing ESCs down отборные линии для терапевтического применения при травмах и дегенеративных расстройствах. Зиготы и их ранние клеточные деления вплоть до стадии морулы определяются как тотипотентные, потому что они могут генерировать целую мышь.На стадии бластоцисты только клетки ICM сохраняют способность генерировать все три первичных зародышевых листка (эктодерма, мезодерма и энтодерма), которые развиваются в органы и ткани тела. ESCs, культивируемые из ICM бластоцисты, можно дифференцировать in vitro и как эмбриоидные тельца. При правильном сочетании факторов роста эти эмбриоидные тела могут дифференцироваться в различные типы клеток. Полученные дифференцированные клетки мыши, полученные из ESC, были использованы в экспериментах по трансплантации на моделях грызунов при травмах и дегенеративных нарушениях.BMP4, костный морфогенетический белок 4; Db-CAMP, дибутирилциклический AMP; EGF, фактор роста эпидермиса; ЭПО, эритропоэтин; FGF2, фактор роста фибробластов 2; ИЛ, интерлейкин; M-CSF, колониестимулирующий фактор макрофагов; PDGF, фактор роста тромбоцитов; РА, ретиноевая кислота; Т3, трийодтиронин.

В нынешнюю эпоху «регенеративной медицины» ученые сейчас сосредоточены на оптимизации условий культивирования, необходимых для того, чтобы заставить культивируемые ЭСК дифференцироваться в определенные типы клеток, такие как сердечные, нервные или эндокринные клоны ().Если желаемый тип клеток может быть произведен в массовом порядке как чистая популяция in vitro , клетки можно протестировать на их способность к репопуляции и восстановлению поврежденных или дегенерирующих тканей. Новые результаты, полученные на мышиных моделях с использованием клоноспецифичных клеток, полученных из ESC, являются многообещающими и предполагают, что заместительная терапия на основе ESC может быть применима для лечения дегенеративных заболеваний человека, связанных с потерей или уменьшением пула определенного типа клеток.

Потенциал терапии стволовыми клетками распространяется на многие заболевания, включая инфаркт миокарда 4 , болезнь Паркинсона 5 , болезнь миелина 6 и печеночную недостаточность 7 ().Многие исследования на мышах, включающие регенеративную терапию с использованием клеток, полученных из ESC, находятся на предварительной стадии, и в большинстве случаев возможность долгосрочного выживания мышей или осложняющих побочных эффектов подробно не анализировалась. Но достигнутые к настоящему времени успехи вдохновляют и предполагают, что технологии, относящиеся к регенеративной терапии на основе ESC, могут быть полезны в клинических условиях.

Перенос ядра соматических клеток

Одной из самых серьезных проблем в использовании клинического потенциала ЭСК является устранение иммунологических барьеров для трансплантации тканей, полученных из ЭСК человека.Использование геномной замены, известной как перенос ядра соматической клетки, предлагает возможное решение иммунного отторжения тканеспецифичных популяций клеток, полученных в результате дифференцировки чужеродных ЭСК. Репрограммированная терапия соматических клеток, называемая терапевтическим клонированием, использует эту технологию для введения ядра взрослой донорской клетки (, например, , ядро ​​В- или Т-лимфоцита 8 ) в энуклеированный ЭСК хозяина для создания гибридной линии ЭСК. Теперь адаптированная для генетического соответствия донору, эта линия ESC может быть дифференцирована в выбранный тип клеток и использована в регенеративной трансплантации для лечения пораженного человека.Одна из проблем заключается в том, что митохондриальный геном по-прежнему будет происходить из исходной линии ESC, и поэтому «чужие» митохондриальные белки будут производиться этими клетками. Исследования на мышах будут полезны для более подробного изучения того, в какой степени эти чужеродные белки могут вызывать иммунную реакцию. Такие исследования станут предпосылкой для применения этой технологии в медицине.

Если отбросить эти оговорки, насколько хорошо работает технология передачи ядер? До сих пор большинство исследований было сосредоточено на переносе ядер от соматических клеток в яйца мыши.Этот метод производит гибридные ESC, называемые ESC с переносом ядра (ntESC), которые затем вводятся в ICM бластоцисты хозяина для создания «клонированной» мыши, а не используются для дифференциации и регенеративной терапии. Клонированные мыши были созданы с помощью этого подхода, что указывает на то, что необходимые технические манипуляции могут быть выполнены без нарушения способности ntESC генерировать все ткани и органы мыши 9 . Что до сих пор модели мышей говорили нам об обещаниях и подводных камнях?

В особенно творческом примере Rideout et al. 10 сочетали терапевтическое клонирование с генной терапией для исправления генетического дефекта в иммунной системе (). В этом подходе перенос ядра был впервые использован для создания ntESC, несущих мутацию в гене, кодирующем рекомбиназу Rag2, который необходим для развития B- и T-клеток. Затем гомологичная рекомбинация была использована для исправления дефекта в Rag2 в культивируемых ntESC. После их восстановления ntESC были использованы для создания мышей, которые показали полное восстановление иммунной функции.Возможно, даже более важным для терапевтического клонирования является то, что репарированные ESC дифференцировались в культуре с образованием гемопоэтических стволовых клеток (HSC), которые затем, как было показано, спасали, по крайней мере частично, облученных Rag2 - / - мышей 10 . Эта работа представляет собой доказательство принципа использования терапии ядерным переносом соматических клеток для лечения генетического заболевания. Неожиданно, однако, первоначальные попытки приживления этих клеток потерпели неудачу из-за увеличения естественных клеток-киллеров.В этом отношении более многообещающие результаты были получены с дифференцировкой ntESCs в определенный тип клеток, который не имеет множества вариантов, переданных стволовым клеткам, включая HSCs. Например, трансплантация дофаминергических нейронов, происходящих из ntESC, по-видимому, корректирует фенотип мышиной модели болезни Паркинсона 11 .

Генная терапия в сочетании с терапевтическим клонированием. Схема эксперимента Rideout et al. 10 , которые использовали технологию ESC и генную терапию для исправления генетических дефектов в системе кроветворения.Клеточные культуры сначала получают из кончиков хвостов иммунодефицитных мышей, гомозиготных по нокаутной мутации в Rag2 . Затем ядра из этих клеток переносятся в энуклеированные ооциты, выделенные от нормальной мыши. Полученные гибридные клетки культивируют и вводят в ICM бластоцист мыши для получения Rag2 - / - ESC или ntESC. Генетическая мутация Rag2 затем корректируется путем гомологичной рекомбинации, и манипулируемые ntESC дифференцируются in vitro сначала в эмбриоидные тельца (EB), а затем в гемопоэтические клетки-предшественники, которые впоследствии повторно вводятся в исходный Rag2 - / - мышей, чтобы вылечить их.

В будущем будет важно производить плюрипотентные ntESCs из ядер людей, пораженных различными генетическими нарушениями человека, и использовать эти плюрипотентные линии для изучения развития и патогенеза этих заболеваний in vitro . Одиннадцать человеческих линий ESC были недавно созданы путем ядерного переноса клеток кожи, полученных от людей с заболеванием или травмой, в донорские ооциты 12 . Кроме того, недавние исследования показывают, что человеческие ESCs, слитые с соматическими фибробластами, могут репрограммировать ядра фибробластов и делать клетки плюрипотентными 13 .

Взрослые стволовые клетки от скамейки к постели

Большинство, если не все, взрослые ткани служат резервуарами стволовых клеток для восполнения клеток, которые теряются в результате повреждения ткани или гомеостаза. Каждый раз, когда образуется легкая рана, взрослые стволовые клетки (ASC) вступают в действие: стволовые клетки волосяного фолликула восстанавливают поврежденный эпидермис и волосяные фолликулы, а HSC восполняют потерянную кровь. ASC используются редко и обычно спрятаны в защищенных нишах, где они существуют в виде неподвижных, недифференцированных и недостаточно представленных компонентов ткани 14 .Выделение и характеристика ASCs создают проблемы не только из-за их статуса меньшинства, но также из-за нехватки определения маркеров клеточной поверхности.

Первыми мультипотентными ASC, которые были очищены и охарактеризованы, были HSC, расположенные в костном мозге мышей 15 . Эти ASC могут восстанавливать гематолимфоидную систему смертельно облученных мышей 16 . Присутствие HSC в костном мозге мышей и людей позволило использовать трансплантаты костного мозга в качестве терапии для лечения людей с апластической анемией, лейкемиями 17 , солидными опухолями, иммунодефицитом и нарушениями гемоглобина.

В последующие годы другие кандидаты ASC были определены только временно по их анатомическим характеристикам и свойствам медленного цикла. Эти кандидаты включают мышечные сателлитные клетки, которые присутствуют под базальной пластинкой зрелых мышечных волокон 18 ; эпителиальные стволовые клетки кожи, которые находятся под сальной железой в волосяном фолликуле в области, известной как «выпуклость» 19 ; стволовые клетки кишечника, расположенные у основания крипт кишечника 20 ; сердечные стволовые клетки 21 , 22 ; стволовые клетки нервного гребня 23 , 24 ; и бронхоальвеолярные стволовые клетки в легком 25 .

ASC обеспечивают возможность коррекции дефектных тканей и органов с помощью аутологичных методов лечения, которые устраняют риск отторжения трансплантата. Подобно стратегиям, основанным на ESC, описанным выше, существует множество моделей заболевания на мышах, показывающих, что после ex vivo генетической модификации аутологичные HSCs могут восстанавливать специфический дефект в гемопоэтическом клоне. Такие исследования сыграли важную роль в разработке и совершенствовании методов лечения различных гематологических заболеваний человека, включая рак ().

Другим вариантом лечения некоторых заболеваний является введение и экспрессия рекомбинантных генов в соматических клетках (, т.е. , генная терапия) с использованием вирусных и невирусных векторов. Среди самых продолжительных и широко освещаемых исследований - исследования, направленные на детей, страдающих тяжелыми комбинированными иммунодефицитами, в которых задерживается дифференцировка Т-клеток 26 . Существует десять генетически различных типов тяжелого комбинированного иммунодефицита, каждый из которых приводит к преждевременной смерти при отсутствии терапии.Предварительные результаты генной терапии с использованием аллогенных HSC казались очень многообещающими, потому что многие люди ответили хорошо. Однако впоследствии у 3 человек из исследования, в котором участвовало около 13 человек, развился Т-клеточный лейкоз. Главный риск, связанный с опосредованным ретровирусом переносом гена, - это случайное внедрение ретровируса в протоонкогены генома. Действительно, лейкозные клетки, выделенные от пораженных людей, содержали вирусную вставку рядом с онкогеном, который, как известно, активируется хромосомной транслокацией 27 .

Одновременно с разработкой HSC для лечения иммунодефицитных расстройств появились эпидермальные стволовые клетки для лечения пациентов с тяжелыми ожогами 28 . В исследованиях, предшествовавших испытаниям на людях, мышей с ослабленным иммунитетом использовали в качестве заменителей культивированных трансплантатов эпидермальных клеток, которые производили и поддерживали здоровый участок эпидермиса человека. Хотя кожа, полученная из культивированных эпидермальных трансплантатов, не потеет и не образует волос, она спасает жизни людей с ожогами и до сих пор используется во многих странах.

После почти двух десятилетий дальнейших обширных исследований на мышах исследователи недавно разработали методы выделения и характеристики мультипотентных стволовых клеток из волосяного фолликула 29 - 31 . Одна из стратегий заключалась в выделении стволовых клеток на основе их характеристик медленного цикла и их экспрессии флуоресцентно меченного трансгена 31 . Чтобы создать универсальную модель для выделения редко циклических клеток, была сконструирована трансгенная мышь, в которой экспрессия гистона h3B, меченного зеленым флуоресцентным белком (GFP), находится под контролем регулирующего элемента, реагирующего на тетрациклин (TRE).Эта мышь может быть скрещена с любой трансгенной мышью, экспрессирующей TRE-связывающий репрессор транскрипции (отключенный тетрациклин) под контролем промотора, специфичного для любого типа клеток. Для тестирования модели промотор кератина-5 использовался для нацеливания выключенного тетрациклина на кератиноциты кожи и других многослойных эпителиальных тканей 31 . При введении доксициклина мышам с пищей экспрессия h3B-GFP была отключена, так что через 4–8 недель только редко повторяющиеся стволовые клетки сохраняли метку.Затем для выделения стволовых клеток использовали сортировку клеток, активируемую флуоресценцией.

В ситуациях, когда мало что известно об ASC ткани и, в частности, когда не были идентифицированы диагностические маркеры клеточной поверхности, модель TRE-h3B-GFP может быть полезна, если подходящий промотор для отключения тетрациклина доступный. Идентификация, очистка и мониторинг клеток с медленным циклом, сохраняющих метку, позволят исследовать степень, в которой клетки могут быть стволовыми.В экспериментах по приживлению кератиноцитов, культивируемых из одной стволовой клетки фолликула, могут образовываться участки флуоресцентного эпидермиса, сальных желез и волос на бестимусных мышах, в остальном голых 29 . Хотя еще слишком рано судить о том, будет ли технология восстановления волос на спине голой мыши превратиться в клиническое лечение заболеваний человеческого волоса, способность определять профиль транскрипции этих клеток открывает путь к выяснению механизмов путем эпителиальные стволовые клетки кожи могут реагировать на внешние сигналы, чтобы вызвать новый виток роста волос.

Успехи в переводе ASC в клинику активизировали поиск ASC в других тканях. Этот интерес был частично вызван этическими противоречиями вокруг потенциального использования ESC в терапии заболеваний человека. Однако, когда дело доходит до лечения заболевания определенного типа клеток, соответствующий ASC может быть полезен из-за его более ограниченного потенциала, при условии, что его можно культивировать in vitro, и уговорить следовать определенной линии.Хотя очень немногие ASC были успешно размножены in vitro , доступность транскрипционных профилей многих ASC определила их репертуар рецепторов клеточной поверхности, что может помочь улучшить условия культивирования в будущем.

Какие еще ASC находятся на горизонте? Мультипотентные клетки нервной ткани из головного мозга взрослой мыши были очищены и могут делиться и давать как нейроны, так и глиальные клетки в культуре 24 , 32 .Кроме того, трансплантация обогащенных нервных популяций показала клиническую полезность при лечении одноклеточных неврологических расстройств, таких как болезнь Паркинсона, которая вызывается деградацией дофаминергических нейронов в полосатом теле 33 . Однако выживаемость привитых дофаминергических нейронов, полученных из расширенного предшественника, низкая (3–5%), что указывает на необходимость повышения выживаемости клеток после трансплантации.

Поджелудочная железа показывает ограниченный клеточный оборот, и был предложен эндогенный источник стволовых клеток для регенерации инсулин-секретирующих клеток поджелудочной железы 34 .Поджелудочная железа содержит островки, секретирующие инсулин, которые регулируют уровень глюкозы у человека и разрушаются аутоиммунной атакой при диабете 1 типа. Поскольку пополнение популяций β-клеток поджелудочной железы сопровождается секрецией эндогенного инсулина, выделение стволовых клеток поджелудочной железы, которые могут продуцировать новые β-клетки, может привести к излечению от диабета 1 типа. Однако недавняя работа показывает на мышах, что уже существующие β-клетки, а не мультипотентные стволовые клетки, являются основным источником новых β-клеток во взрослой жизни и после панкреатэктомии 35 .Эта работа предполагает, что дифференцированные клетки ткани могут сохранять пролиферативную способность in vivo.

Скелетные мышцы представляют собой интересный пример для биологов, которые традиционно ищут стволовые клетки в определенной нише или резервуаре. Митотически покоящиеся миогенные предшественники называются сателлитными стволовыми клетками. Несмотря на то, что сателлитные стволовые клетки привлекли к себе большое внимание при лечении людей, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна, функциональные свойства этих мышечных стволовых клеток остаются неясными.Клональная популяция мышечных клеток-предшественников была идентифицирована и после внутримышечной или внутривенной инъекции приводит к регенерации мышц и частичному восстановлению дистрофина у мышей mdx , модели мышечной дистрофии Дюшенна 36 . После внутриартериальной инъекции изолированные мышечные предшественники, по-видимому, приживают дистрофические мышцы мышей и участвуют в регенерации после повреждения мышц 37 , 38 . Остается неясным, представляют ли какие-либо из этих культивируемых клеток чистый пул стволовых клеток; тем не менее, линии миогенных клеток могут быть полезны в качестве источника миогенных предшественников для прямой или системной трансплантации.

Анализ свойств предполагаемых генов стволовых клеток

С появлением технологии массивов генов молекулярная характеристика стволовых клеток сделала шаг вперед, предоставив исчерпывающие снимки транскрипционных профилей этих клеток. Этот прогресс побудил исследователей обратиться к некоторым фундаментальным вопросам биологии стволовых клеток. Являются ли определенные особенности общими для всех стволовых клеток? Чем ASC отличаются от ESC? Какие молекулярные механизмы контролируют состояние покоя стволовых клеток и их способность к самообновлению? И как стволовые клетки активируются при их превращении из неподвижной мультипотентной клетки в коммитированную клетку, которая временно делится и дифференцируется по определенному клону?

Две основные проблемы стоят перед исследователями, пытающимися использовать транскрипционный репертуар мультипотентных стволовых клеток.Первый - это разработка стратегий выделения и очистки этих второстепенных компонентов ткани; второй - выбор того, с чем сравнивать эти ячейки. В ранних исследованиях такого рода Иванова и соавт. 39 использовали маркеры клеточной поверхности и клеточную сортировку, активируемую флуоресценцией, для выделения и определения профиля транскрипции HSC и их ранних коммитированных транзиентных потомков амплификации. Рамальо-Сантос и др. 40 использовали аналогичные методы для выделения HSC, но сравнили их профили транскрипции с профилями цельного костного мозга.Несмотря на воспроизводимые данные массива для HSC, список того, что составляет «стволовость» HSC, заметно отличался в двух исследованиях. Одна группа определила гены, которые были активированы в HSC по сравнению со всей гетерогенной тканью, окружающей клетки, тогда как другая определила гены, экспрессия которых изменилась, поскольку HSCs изменили свои свойства и вступили в клон. Оба типа сравнения полезны, но они дают очень разную информацию.

Поскольку все больше стволовых клеток и их потомков выделяются и профилируются, подробные данные об экспрессии накапливаются с большой скоростью.Ученые начали пожинать плоды этих молекулярных сигнатур, более глубоко исследуя механизмы, с помощью которых стволовые клетки поддерживаются в их нишах в состоянии покоя и дифференцировки, и как они становятся мобилизованными, когда они покидают свои ниши и выбирают определенную линию.

Многие примеры показывают, как молекулярные маркеры, иногда в сочетании с моделями трансгенных и нокаутных мышей, дают представление о механизмах, лежащих в основе поддержания и самообновления стволовых клеток.Hoxb4, например, представляет собой фактор транскрипции, содержащий гомеодомен, который обнаружен в нескольких различных массивах. Hoxb4 увеличивает жизнеспособность и пролиферацию при сверхэкспрессии в мышиных HSC 41 , что, в свою очередь, дает повышенную эффективность спасения при трансплантации мышам с истощенными HSC. Другим примером является Bmi-1, член регулирующего хроматин комплекса Polycomb, который необходим для генерации самообновляющихся взрослых HSCs 42 и для самообновления нервных стволовых клеток 43 .

Не менее важны, чем факторы ремоделирования хроматина, в управлении стволовыми клетками пути передачи сигнала. Передача сигналов Wnt стала универсальным регулятором стволовых клеток, но то, как именно Wnts действуют на стволовые клетки, остается предметом интенсивных дискуссий 44 . Клетки отвечают на каноническую передачу сигналов Wnt, стабилизируя избыток β-катенина, который не используется в клеточной адгезии. Этот стабилизированный β-катенин затем может свободно связываться и действовать как транскрипционный кофактор для членов семейства ДНК-связывающих белков Lef1 или Tcf.Трансгенная сверхэкспрессия конститутивно стабилизированной версии β-catenin в эпидермисе кожи приводит к морфогенезу de novo волосяных фолликулов, что характерно для мультипотентных эмбриональных стволовых клеток кожи, но не для эпидермиса взрослых 45 . Немного более низкие уровни передачи сигналов Wnt приводят к активации ASC существующих волосяных фолликулов 46 . Напротив, мутации с потерей функции в β-catenin полностью блокируют образование волосяных фолликулов 47 . В кишечнике потеря партнера β-катенина Tcf4 блокирует образование ткани 48 .

В нервной системе трансгенная сверхэкспрессия β-катенина приводит к увеличению мозга и увеличению популяции предшественников 49 , тогда как в стволовых клетках нервного гребня стабилизированный β-катенин мало влияет на размер популяции и вместо этого регулирует решения судьбы 50 . В предшественниках костного мозга инактивация β-catenin in vivo , по-видимому, не нарушает способность этих клеток к самообновлению и воссозданию гематопоэтических клонов 51 .Но сверхэкспрессия β-катенина в культивируемых потомках изолированных HSC способствует пролиферации этих клеток, которые при введении в кровь смертельно облученных мышей, по крайней мере, поддерживают продукцию миелоидных, B- и T-клеточных линий 52 .

В то время как исследователи изучают механизмы, лежащие в основе передачи сигналов Wnt в биологии стволовых клеток, они также изучают, как другие пути могут действовать согласованно, чтобы интегрировать биологию стволовых клеток. Подобно передаче сигналов Wnt, передача сигналов Notch и костных морфогенетических белков, по-видимому, оказывает плейотропные эффекты на стволовые клетки и их клоны, и эти эффекты, по-видимому, различаются для разных стволовых клеток 53 .Остается неясным, действуют ли эти факторы на уровне самообновления стволовых клеток, активации стволовых клеток или кратковременной амплифицирующей пролиферации или дифференцировки клеток. Напр., Нарушение ткани, наблюдаемое в моделях нокаута мышей, может возникать либо из-за дефекта стволовых клеток, либо из-за неспособности пролиферировать потомство временных амплифицирующих клеток. Точно так же влияние сигнального фактора на пролиферацию культивируемых стволовых клеток может быть либо признаком повышенной пролиферации потомства временных амплифицирующих клеток в культуре, либо признаком самообновления стволовых клеток.По мере проведения будущих исследований должно стать очевидным, поддерживаются и размножаются ли стволовые клетки с помощью общего набора регуляторных путей и молекулярных принципов, или кажущееся противоположное влияние сигнальных молекул на поведение различных клеток является отражением разнообразия. ИСК.

Стволовые клетки дома

В тканях взрослых мультипотентные стволовые клетки часто спрятаны в защищенных местах или нишах. Самая защищенная ниша - это костный мозг, в котором находятся ГСК.Кожу можно микродиссектировать на единицы, в которых каждый волосяной фолликул имеет крошечную нишу (выпуклость) стволовых клеток, которые отвечают за образование новых волос во время цикла роста волос и за пополнение клеток сальной железы и эпидермиса при травмах. 54 . Точно так же кишечник состоит из сотен единиц, каждая из которых содержит ворсинки и крипту, а стволовые клетки расположены кольцом прямо над основанием крипты. Стволовые клетки в каждой крипте ответственны за создание четырех линий абсорбционных и секреторных клеток, которые составляют крипту и ворсинку 20 .В центральной нервной системе взрослого человека стволовые клетки расположены в субвентрикулярной зоне, где они могут генерировать глию и нейроны 24 .

Важность ниши лучше всего иллюстрируется экспериментами, в которых судьба ESCs отслеживается после их подкожной инъекции иммунодефицитным голым мышам. При помещении в инородную среду окружающей in vivo ткани, ESC образуют доброкачественные тератомы, которые содержат множество типов клеток 55 .Это исследование показывает важность соответствующей микросреды для конкретных межклеточных взаимодействий и клеточной организации.

Большинство стволовых клеток совершают дифференцировку по определенным линиям, когда они покидают свою нишу. ГСК кажутся исключением, потому что они могут циркулировать в кровотоке и возвращаться домой относительно невредимыми в процессе, называемом наведением 56 . Эксперименты с использованием генетически маркированных мышей с парабиотиками CD45.1 и CD45.2, которые имеют общую циркуляцию, были проведены для изучения миграции HSC из костного мозга через кровь 57 .Результаты показывают, что HSC, обнаруживаемые в периферической крови, мигрировали из своей ниши, что приводит к возможности того, что HSC, передаваемые через кровь, могут быть источником плюрипотентных или мультипотентных стволовых клеток, доступных для восстановления как негематопоэтических, так и гематопоэтических тканей 57 .

Поскольку стволовые клетки зависят от окружающей среды для поддержания своих свойств стволовых клеток, развитие ниши имеет решающее значение 14 . Внутри ниши стволовые клетки обычно поддерживают среду, препятствующую росту и дифференцировке.Каждый раз, когда стволовой клетке предлагается покинуть нишу, ее необходимо пополнять, предположительно путем самообновления. И наоборот, чтобы стволовая клетка покинула нишу и последовала определенному клону, ее микросреда должна измениться, накапливать или утратить важные факторы, которые в противном случае удерживают ее в ее нише.

Генетические исследования половых клеток Drosophila melanogaster дают лучшее представление о том, как это изменение могло произойти. 58 . Хотя исследования ниш млекопитающих отстают, недавняя характеристика и генетические манипуляции с мышиными ASC и их нишами привели к прогрессу в нашем понимании того, что составляет эту среду в биологии стволовых клеток млекопитающих.Такие исследования также дали представление о том, как ключевые сигнальные пути регулируют поведение стволовых клеток.

Среди наиболее интересных достижений в этой области - исследования глубины ниши костного мозга HSC, выстланной пространственно ориентированными остеобластами. По мере того, как HSC прогрессивно созревают, они теряют контакт с этими соседними стромальными клетками, становятся более пролиферативными, направляются в центральную полость костного мозга и проникают в кровеносные сосуды. Когда мышей генетически изменяют для увеличения популяции остеобластов на внутренней поверхности кости, количество HSC одновременно увеличивается, и способность этих новых HSC сохранять свои свойства медленного цикла, по-видимому, зависит от их способности напрямую прикрепляться к остеобластам через N-кадгерин. –Опосредованные спаечные соединения 59 .Эти исследования выявили решающую роль остеобластов в поддержании долгоживущих и наиболее ценных HSC. Данные также показывают, что по крайней мере некоторые HSC контактируют с синусоидальным эндотелием кровеносных сосудов в костном мозге, что может объяснить, почему HSC могут быть мобилизованы в кровоток с очень быстрой кинетикой 60 . Примечательно, что недавно было показано, что эмбриональные стволовые клетки кожи используют адгезивные соединения для контроля асимметричного деления клеток, что может иметь широкое значение для стволовых клеток 61 .

В заключение следует отметить, что характеристика стволовых клеток мышей и манипуляции с ними привели к широкому спектру клинических применений и многообещающим направлениям для будущих исследований. Внедряя эту мощную технологию из области моделей мышей в клинические условия, ученым всего мира необходимо будет разработать руководящие принципы, которые сбалансируют моральные и этические соображения с пользой для терапевтической медицины. При этом ответственность за эффективное общение и убеждение общественности в важности продвижения вперед лежит на ученых.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарим M. Schober, V. Horsley и C. Blanpain за обсуждения и советы во время подготовки этого обзора. Г.Г. является получателем программы Human Frontier Science Programme. E.F. - исследователь Медицинского института Говарда Хьюза и получатель финансирования от Национальных институтов здравоохранения США.

Ссылки

1. Evans MJ, Kaufman MH. Создание в культуре плюрипотенциальных клеток из эмбрионов мыши. Природа. 1981; 292: 154–156. [PubMed] [Google Scholar] 2.Мартин ГР. Выделение линии плюрипотентных клеток из ранних эмбрионов мыши, культивированных в среде, кондиционированной стволовыми клетками тератокарциномы. Proc. Natl. Акад. Sci. США. 1981; 78: 7634–7638. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 3. Брэдли А., Эванс М., Кауфман М. Х., Робертсон Э. Формирование химер зародышевой линии из клеточных линий тератокарциномы, полученных из эмбрионов. Природа. 1984. 309: 255–256. [PubMed] [Google Scholar] 4. Клуг MG, Soonpaa MH, Koh GY, Field LJ. Генетически отобранные кардиомиоциты из дифференцирующихся эмбриональных стволовых клеток образуют стабильные внутрисердечные трансплантаты.J. Clin. Вкладывать деньги. 1996. 98: 216–224. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 5. Ким Дж. Х. и др. Дофаминовые нейроны, полученные из эмбриональных стволовых клеток, функционируют в животной модели болезни Паркинсона. Природа. 2002; 418: 50–56. [PubMed] [Google Scholar] 6. Brustle O и др. Глиальные предшественники, полученные из эмбриональных стволовых клеток: источник миелинизирующих трансплантатов. Наука. 1999. 285: 754–756. [PubMed] [Google Scholar] 7. Chinzei R, et al. Клетки эмбриональных тельцов, полученные из линии эмбриональных стволовых клеток мыши, дифференцируются в функциональные гепатоциты.Гепатология. 2002; 36: 22–29. [PubMed] [Google Scholar] 8. Hochedlinger K, Jaenisch R. Моноклональные мыши, полученные путем переноса ядра из зрелых B- и T-донорных клеток. Природа. 2002; 415: 1035–1038. [PubMed] [Google Scholar] 9. Вакаяма Т. и др. Дифференциация линий эмбриональных стволовых клеток, полученных из взрослых соматических клеток путем переноса ядра. Наука. 2001; 292: 740–743. [PubMed] [Google Scholar] 10. Rideout WM, III, Hochedlinger K, Kyba M, Daley GQ, Jaenisch R. Исправление генетического дефекта с помощью ядерной трансплантации и комбинированной клеточной и генной терапии.Клетка. 2002; 109: 17–27. [PubMed] [Google Scholar] 11. Барбери Т. и др. Спецификация нейронного подтипа эмбриональных стволовых клеток при оплодотворении и переносе ядра и применение у мышей с паркинсонизмом. Nat. Biotechnol. 2003. 21: 1200–1207. [PubMed] [Google Scholar] 12. Hwang WS и др. Эмбриональные стволовые клетки, специфичные для пациента, полученные из бластоцист SCNT человека. Наука. 2005; 308: 1777–1783. [PubMed] [Google Scholar] 13. Cowan CA, Atienza J, Melton DA, Eggan K. Ядерное перепрограммирование соматических клеток после слияния с человеческими эмбриональными стволовыми клетками.Наука. 2005; 309: 1369–1373. [PubMed] [Google Scholar] 14. Фукс Э., Тумбар Т., Гуаш Г. Общение с соседями: стволовые клетки и их ниша. Клетка. 2004. 116: 769–778. [PubMed] [Google Scholar] 15. Spangrude GJ, Heimfeld S, Weissman IL. Очистка и характеристика гемопоэтических стволовых клеток мыши. Наука. 1988. 241: 58–62. [PubMed] [Google Scholar] 16. Ford CE, Hamerton JL, Barnes DW, Loutit JF. Цитологическая идентификация радиационных химер. Природа. 1956; 177: 452–454. [PubMed] [Google Scholar] 17.Бакнер CD и др. Аллогенное приживление костного мозга после облучения всего тела у пациента с лейкемией. Кровь. 1970; 35: 741–750. [PubMed] [Google Scholar] 18. Сил П., Асакура А., Рудницкий М.А. Потенциал мышечных стволовых клеток. Dev. Клетка. 2001; 1: 333–342. [PubMed] [Google Scholar] 19. Cotsarelis G, Sun TT, Lavker RM. Клетки, сохраняющие метку, находятся в области выпуклости волосистой части тела: это влияет на фолликулярные стволовые клетки, цикл роста волос и канцерогенез кожи. Клетка. 1990; 61: 1329–1337. [PubMed] [Google Scholar] 20.Loeffler M, Birke A, Winton D, Potten C. Соматические мутации, моноклональность и стохастические модели организации стволовых клеток в кишечном крипте. J. Theor. Биол. 1993; 160: 471–491. [PubMed] [Google Scholar] 21. Бельтрами А.П. и др. Взрослые кардиальные стволовые клетки мультипотентны и поддерживают регенерацию миокарда. Клетка. 2003. 114: 763–776. [PubMed] [Google Scholar] 23. Buchstaller J, et al. Эффективное выделение и профилирование экспрессии генов небольшого количества стволовых клеток нервного гребня и развивающихся шванновских клеток.J. Neurosci. 2004. 24: 2357–2365. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 24. Doetsch F, Caille I, Lim DA, Garcia-Verdugo JM, Alvarez-Buylla A. Астроциты субвентрикулярной зоны представляют собой нервные стволовые клетки в мозге взрослых млекопитающих. Клетка. 1999; 97: 703–716. [PubMed] [Google Scholar] 25. Kim CF, et al. Идентификация бронхоальвеолярных стволовых клеток при нормальном раке легких и легких. Клетка. 2005; 121: 823–835. [PubMed] [Google Scholar] 26. Cavazzana-Calvo M, et al. Генная терапия тяжелого комбинированного иммунодефицита человека (SCID) -X1 болезни.Наука. 2000. 288: 669–672. [PubMed] [Google Scholar] 27. Hacein-Bey-Abina S, et al. LMO2-ассоциированная пролиферация клональных Т-клеток у двух пациентов после генной терапии SCID-X1. Наука. 2003. 302: 415–419. [PubMed] [Google Scholar] 28. Gallico GG, III, O'Connor NE, Compton CC, Kehinde O, Green H. Постоянное покрытие больших ожоговых ран аутологичным культивированным эпителием человека. N. Engl. J. Med. 1984; 311: 448–451. [PubMed] [Google Scholar] 29. Blanpain C, Lowry WE, Geoghegan A, Polak L, Fuchs E. Самообновление, мультипотентность и существование двух популяций клеток в нише эпителиальных стволовых клеток.Клетка. 2004. 118: 635–648. [PubMed] [Google Scholar] 30. Моррис Р.Дж. и др. Захват и профилирование стволовых клеток взрослых волосяных фолликулов. Nat. Biotechnol. 2004; 22: 411–417. [PubMed] [Google Scholar] 32. Rietze RL, et al. Очистка плюрипотентных нервных стволовых клеток из мозга взрослой мыши. Природа. 2001; 412: 736–739. [PubMed] [Google Scholar] 33. Studer L, Tabar V, McKay RD. Трансплантация расширенных предшественников мезэнцефалита приводит к выздоровлению крыс с паркинсонизмом. Nat. Neurosci. 1998; 1: 290–295. [PubMed] [Google Scholar] 34.Сиберг Р.М. и др. Клональная идентификация мультипотентных предшественников из поджелудочной железы взрослых мышей, которые генерируют нервные и панкреатические клоны. Nat. Biotechnol. 2004. 22: 1115–1124. [PubMed] [Google Scholar] 35. Дор Й, Браун Дж, Мартинес О.И., Мелтон Д.А. Взрослые β-клетки поджелудочной железы образуются путем самодублирования, а не дифференцировки стволовых клеток. Природа. 2004; 429: 41–46. [PubMed] [Google Scholar] 36. Ли JY и др. Клональная изоляция мышечных клеток, способных улучшить регенерацию мышц и заживление костей.J. Cell Biol. 2000; 150: 1085–1100. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 37. Torrente Y, et al. Внутриартериальная инъекция мышечных стволовых клеток CD34 + Sca-1 + восстанавливает дистрофин у мышей mdx . J. Cell Biol. 2001. 152: 335–348. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 38. Collins CA, et al. Функция стволовых клеток, самообновление и поведенческая неоднородность клеток из ниши взрослых мышечных сателлитных клеток. Клетка. 2005; 122: 289–301. [PubMed] [Google Scholar] 39.Иванова Н.Б., и др. Молекулярная сигнатура стволовых клеток. Наука. 2002; 298: 601–604. [PubMed] [Google Scholar] 40. Рамальо-Сантос М., Юн С., Мацузаки Ю., Маллиган Р.С., Мелтон Д.А. «Стебель»: профили транскрипции эмбриональных и взрослых стволовых клеток. Наука. 2002; 298: 597–600. [PubMed] [Google Scholar] 41. Антончук Дж., Соважо Дж., Хамфрис РК. HOXB4-индуцированная экспансия взрослых гемопоэтических стволовых клеток ex vivo . Клетка. 2002; 109: 39–45. [PubMed] [Google Scholar] 42. Парк И.К. и др. Bmi-1 необходим для поддержания самообновляющихся гемопоэтических стволовых клеток взрослых.Природа. 2003; 423: 302–305. [PubMed] [Google Scholar] 43. Молофский А.В., и др. Зависимость от Bmi-1 отличает самообновление нервных стволовых клеток от пролиферации предшественников. Природа. 2003; 425: 962–967. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 44. Клебер М., Соммер Л. Передача сигналов Wnt и регуляция функции стволовых клеток. Curr. Opin. Cell Biol. 2004. 16: 681–687. [PubMed] [Google Scholar] 45. Gat U, DasGupta R, Degenstein L, Fuchs E. De novo Морфогенез волосяного фолликула и опухоли волос у мышей, экспрессирующих усеченный β-катенин в коже.Клетка. 1998. 95: 605–614. [PubMed] [Google Scholar] 47. Huelsken J, Vogel R, Erdmann B, Cotsarelis G, Birchmeier W. β-Катенин контролирует морфогенез волосяного фолликула и дифференцировку стволовых клеток в коже. Клетка. 2001; 105: 533–545. [PubMed] [Google Scholar] 48. Коринек В. и др. Истощение компартментов эпителиальных стволовых клеток в тонком кишечнике мышей, лишенных Tcf-4. Nat. Genet. 1998. 19: 379–383. [PubMed] [Google Scholar] 49. Ченн А., Уолш, Калифорния. Регулирование размера коры головного мозга путем контроля выхода из клеточного цикла в нервных предшественниках.Наука. 2002. 297: 365–369. [PubMed] [Google Scholar] 50. Ли Х.Й. и др. Инструктивная роль Wnt / β-catenin в спецификации сенсорной судьбы в стволовых клетках нервного гребня. Наука. 2004. 303: 1020–1023. [PubMed] [Google Scholar] 52. Рейя Т. и др. Роль передачи сигналов Wnt в самообновлении гемопоэтических стволовых клеток. Природа. 2003; 423: 409–414. [PubMed] [Google Scholar] 53. Дункан А.В. и др. Интеграция передачи сигналов Notch и Wnt в поддержание гемопоэтических стволовых клеток. Nat. Иммунол. 2005. 6: 314–322. [PubMed] [Google Scholar] 54.Осима Х., Рочат А., Кедзия С., Кобаяши К., Баррандон Ю. Морфогенез и обновление волосяных фолликулов из взрослых мультипотентных стволовых клеток. Клетка. 2001; 104: 233–245. [PubMed] [Google Scholar] 55. Томсон Дж. А. и др. Линии эмбриональных стволовых клеток, полученные из бластоцист человека. Наука. 1998. 282: 1145–1147. [PubMed] [Google Scholar] 56. Quesenberry PJ, Colvin G, Abedi M. Перспектива: фундаментальные и клинические концепции самонаведения и приживления стволовых клеток: путешествие в ниши и за их пределы. Exp. Гематол. 2005; 33: 9–19.[PubMed] [Google Scholar] 57. Райт Д.Е., Уэйджерс А.Дж., Гулати А.П., Джонсон, Флорида, Вайсман, Иллинойс. Физиологическая миграция гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников. Наука. 2001; 294: 1933–1936. [PubMed] [Google Scholar] 58. Ямасита Ю.М., Фуллер М.Т., Джонс Д.Л. Передача сигналов в нишах стволовых клеток: уроки зародышевой линии Drosophila . J. Cell Sci. 2005. 118: 665–672. [PubMed] [Google Scholar] 59. Чжан Дж. И др. Идентификация ниши гемопоэтических стволовых клеток и контроль размера ниши. Природа. 2003; 425: 836–841.[PubMed] [Google Scholar] 60. Киль MJ и др. Рецепторы семейства SLAM различают гемопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники и выявляют эндотелиальные ниши для стволовых клеток. Клетка. 2005; 121: 1109–1121. [PubMed] [Google Scholar] 61. Lechler T, Fuchs E. Асимметричные деления клеток способствуют расслоению и дифференцировке кожи млекопитающих. Природа. 2005; 437: 275–280. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 62. Гудман Дж. В., Ходжсон Г. С.. Доказательства наличия стволовых клеток в периферической крови мышей. Кровь. 1962; 19: 702–714.[PubMed] [Google Scholar] 63. Flanagan SP. «Nude», новый ген безволосости с плейотропными эффектами у мышей. Genet. Res. 1966; 8: 295–309. [PubMed] [Google Scholar] 64. Харрисон DE. Конкурентная репопуляция: новый анализ долгосрочной функциональной способности стволовых клеток. Кровь. 1980; 55: 77–81. [PubMed] [Google Scholar] 65. Томас KR, Капеччи MR. Сайт-направленный мутагенез путем нацеливания на ген в стволовых клетках, полученных из эмбрионов мыши. Клетка. 1987. 51: 503–512. [PubMed] [Google Scholar] 66. МакКьюн Дж. М. и др. Мышь SCID-hu: мышиная модель для анализа дифференцировки и функции гематолимфоидов человека.Наука. 1988; 241: 1632–1639. [PubMed] [Google Scholar] 67. Томпсон С., Кларк А. Р., Пау А. М., Хупер М. Л., Мелтон Д. В.. Передача по зародышевой линии и экспрессия скорректированного гена HPRT, продуцируемого нацеливанием гена в эмбриональных стволовых клетках. Клетка. 1989; 56: 313–321. [PubMed] [Google Scholar] 68. Любин И. и др. Приживление и развитие человеческих Т- и В-клеток у мышей после трансплантации костного мозга. Наука. 1991; 252: 427–431. [PubMed] [Google Scholar] 69. Shinkai Y, et al. У мышей с дефицитом RAG-2 отсутствуют зрелые лимфоциты из-за неспособности инициировать перестройку V (D) J.Клетка. 1992. 68: 855–867. [PubMed] [Google Scholar] 70. Кэмпбелл К.Х., МакВир Дж., Ричи В.А., Уилмут И. Овцы, клонированные путем переноса ядра из культивируемой клеточной линии. Природа. 1996. 380: 64–66. [PubMed] [Google Scholar] 71. Томсон Дж. А. и др. Линии эмбриональных стволовых клеток, полученные из бластоцист человека. Наука. 1998. 282: 1145–1147. [PubMed] [Google Scholar] 72. Munsie MJ, et al. Выделение плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток из перепрограммированных ядер соматических клеток взрослых мышей. Curr. Биол. 2000; 10: 989–992. [PubMed] [Google Scholar] 73.Динсмор Дж. И др. Эмбриональные стволовые клетки дифференцировали in vitro и как новый источник клеток для трансплантации. Трансплантация клеток. 1996. 5: 131–143. [PubMed] [Google Scholar] 74. Ямамото Х. и др. Дифференциация эмбриональных стволовых клеток в гепатоциты: биологические функции и терапевтическое применение. Гепатология. 2003; 37: 983–993. [PubMed] [Google Scholar] 75. Мин JY и др. Трансплантация эмбриональных стволовых клеток улучшает сердечную функцию у постинфарктных крыс. J. Appl. Physiol. 2002. 92: 288–296.[PubMed] [Google Scholar]

мышей в мире биологии стволовых клеток

Nat Genet. Авторская рукопись; доступно в PMC 2008 30 мая.

Опубликован в окончательной редакции как:

PMCID: PMC2405927

NIHMSID: NIHMS44874

Медицинский институт Говарда Хьюза, Университет Рокфеллера, Лаборатория клеточной биологии и развития млекопитающих Йорк, 1230 Box 300, Нью-Йорк, Нью-Йорк 10021, США.

Окончательная отредактированная версия этой статьи издателем доступна на сайте Nat Genet. См. Другие статьи в PMC, в которых цитируется опубликованная статья.

Abstract

Способность эмбрионов к разнообразию и некоторых взрослых тканей к регенерации на протяжении всей жизни напрямую связана со стволовыми клетками. Эти клетки обладают способностью к самообновлению, то есть к делению и созданию дополнительных стволовых клеток, а также к дифференцировке по определенной линии. Дифференциация плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток по определенным клеточным линиям используется для понимания молекулярных механизмов, участвующих в развитии тканей. Часто безграничная способность эмбриональных стволовых клеток генерировать дифференцированные типы клеток позиционирует область стволовых клеток на стыке между биологами развития, которые очарованы свойствами этих клеток, и клиницистами, которые воодушевлены перспективами получения стволовых клеток из скамейка у постели больного для лечения дегенеративных заболеваний и травм, от которых в настоящее время нет лекарств.Здесь мы подчеркиваем важность мышей в биологии стволовых клеток и в том, чтобы сделать мир еще на шаг ближе к тому, чтобы увидеть, как эти клетки воплощаются в жизнь в современной медицине.

Эмбриональные стволовые клетки как источник для заместительной клеточной терапии

Эмбриональные стволовые клетки мыши (ESC) были впервые выделены с помощью in vitro культуры клеток, выделенных из внутренней клеточной массы (ICM) ранних эмбрионов или бластоцист 1 , 2 (). В соответствующих условиях культивирования ESC могут пролиферировать бесконечно долго, сохраняя при этом способность дифференцироваться во все типы соматических клеток ().Когда культивируемые ESC вводятся в ICM эмбрионов мыши, которые затем переносятся в маточный проток приемной матери-мыши, полученное потомство имеет химерные ткани и органы, состоящие из клеток, которые происходят частично из ESC, а частично из ICM. Поскольку происходящие из ESC половые клетки также присутствуют у химерных мышей-основателей, это мощный подход для внесения специфических генетических изменений в зародышевую линию мыши 3 .

Хронология основных открытий в исследовании стволовых клеток мышей.Показаны многие важные открытия, сделанные за последние 50 лет, когда исследователи использовали мышей в качестве модельных систем для создания основ биологии стволовых клеток. Эта работа имела фундаментальное значение для внедрения исследований стволовых клеток в клинические условия. LT-HSC, долгосрочные HSC; SCID-Hu, тяжелый комбинированный иммунодефицит человека.

Coaxing ESCs down отборные линии для терапевтического применения при травмах и дегенеративных расстройствах. Зиготы и их ранние клеточные деления вплоть до стадии морулы определяются как тотипотентные, потому что они могут генерировать целую мышь.На стадии бластоцисты только клетки ICM сохраняют способность генерировать все три первичных зародышевых листка (эктодерма, мезодерма и энтодерма), которые развиваются в органы и ткани тела. ESCs, культивируемые из ICM бластоцисты, можно дифференцировать in vitro и как эмбриоидные тельца. При правильном сочетании факторов роста эти эмбриоидные тела могут дифференцироваться в различные типы клеток. Полученные дифференцированные клетки мыши, полученные из ESC, были использованы в экспериментах по трансплантации на моделях грызунов при травмах и дегенеративных нарушениях.BMP4, костный морфогенетический белок 4; Db-CAMP, дибутирилциклический AMP; EGF, фактор роста эпидермиса; ЭПО, эритропоэтин; FGF2, фактор роста фибробластов 2; ИЛ, интерлейкин; M-CSF, колониестимулирующий фактор макрофагов; PDGF, фактор роста тромбоцитов; РА, ретиноевая кислота; Т3, трийодтиронин.

В нынешнюю эпоху «регенеративной медицины» ученые сейчас сосредоточены на оптимизации условий культивирования, необходимых для того, чтобы заставить культивируемые ЭСК дифференцироваться в определенные типы клеток, такие как сердечные, нервные или эндокринные клоны ().Если желаемый тип клеток может быть произведен в массовом порядке как чистая популяция in vitro , клетки можно протестировать на их способность к репопуляции и восстановлению поврежденных или дегенерирующих тканей. Новые результаты, полученные на мышиных моделях с использованием клоноспецифичных клеток, полученных из ESC, являются многообещающими и предполагают, что заместительная терапия на основе ESC может быть применима для лечения дегенеративных заболеваний человека, связанных с потерей или уменьшением пула определенного типа клеток.

Потенциал терапии стволовыми клетками распространяется на многие заболевания, включая инфаркт миокарда 4 , болезнь Паркинсона 5 , болезнь миелина 6 и печеночную недостаточность 7 ().Многие исследования на мышах, включающие регенеративную терапию с использованием клеток, полученных из ESC, находятся на предварительной стадии, и в большинстве случаев возможность долгосрочного выживания мышей или осложняющих побочных эффектов подробно не анализировалась. Но достигнутые к настоящему времени успехи вдохновляют и предполагают, что технологии, относящиеся к регенеративной терапии на основе ESC, могут быть полезны в клинических условиях.

Перенос ядра соматических клеток

Одной из самых серьезных проблем в использовании клинического потенциала ЭСК является устранение иммунологических барьеров для трансплантации тканей, полученных из ЭСК человека.Использование геномной замены, известной как перенос ядра соматической клетки, предлагает возможное решение иммунного отторжения тканеспецифичных популяций клеток, полученных в результате дифференцировки чужеродных ЭСК. Репрограммированная терапия соматических клеток, называемая терапевтическим клонированием, использует эту технологию для введения ядра взрослой донорской клетки (, например, , ядро ​​В- или Т-лимфоцита 8 ) в энуклеированный ЭСК хозяина для создания гибридной линии ЭСК. Теперь адаптированная для генетического соответствия донору, эта линия ESC может быть дифференцирована в выбранный тип клеток и использована в регенеративной трансплантации для лечения пораженного человека.Одна из проблем заключается в том, что митохондриальный геном по-прежнему будет происходить из исходной линии ESC, и поэтому «чужие» митохондриальные белки будут производиться этими клетками. Исследования на мышах будут полезны для более подробного изучения того, в какой степени эти чужеродные белки могут вызывать иммунную реакцию. Такие исследования станут предпосылкой для применения этой технологии в медицине.

Если отбросить эти оговорки, насколько хорошо работает технология передачи ядер? До сих пор большинство исследований было сосредоточено на переносе ядер от соматических клеток в яйца мыши.Этот метод производит гибридные ESC, называемые ESC с переносом ядра (ntESC), которые затем вводятся в ICM бластоцисты хозяина для создания «клонированной» мыши, а не используются для дифференциации и регенеративной терапии. Клонированные мыши были созданы с помощью этого подхода, что указывает на то, что необходимые технические манипуляции могут быть выполнены без нарушения способности ntESC генерировать все ткани и органы мыши 9 . Что до сих пор модели мышей говорили нам об обещаниях и подводных камнях?

В особенно творческом примере Rideout et al. 10 сочетали терапевтическое клонирование с генной терапией для исправления генетического дефекта в иммунной системе (). В этом подходе перенос ядра был впервые использован для создания ntESC, несущих мутацию в гене, кодирующем рекомбиназу Rag2, который необходим для развития B- и T-клеток. Затем гомологичная рекомбинация была использована для исправления дефекта в Rag2 в культивируемых ntESC. После их восстановления ntESC были использованы для создания мышей, которые показали полное восстановление иммунной функции.Возможно, даже более важным для терапевтического клонирования является то, что репарированные ESC дифференцировались в культуре с образованием гемопоэтических стволовых клеток (HSC), которые затем, как было показано, спасали, по крайней мере частично, облученных Rag2 - / - мышей 10 . Эта работа представляет собой доказательство принципа использования терапии ядерным переносом соматических клеток для лечения генетического заболевания. Неожиданно, однако, первоначальные попытки приживления этих клеток потерпели неудачу из-за увеличения естественных клеток-киллеров.В этом отношении более многообещающие результаты были получены с дифференцировкой ntESCs в определенный тип клеток, который не имеет множества вариантов, переданных стволовым клеткам, включая HSCs. Например, трансплантация дофаминергических нейронов, происходящих из ntESC, по-видимому, корректирует фенотип мышиной модели болезни Паркинсона 11 .

Генная терапия в сочетании с терапевтическим клонированием. Схема эксперимента Rideout et al. 10 , которые использовали технологию ESC и генную терапию для исправления генетических дефектов в системе кроветворения.Клеточные культуры сначала получают из кончиков хвостов иммунодефицитных мышей, гомозиготных по нокаутной мутации в Rag2 . Затем ядра из этих клеток переносятся в энуклеированные ооциты, выделенные от нормальной мыши. Полученные гибридные клетки культивируют и вводят в ICM бластоцист мыши для получения Rag2 - / - ESC или ntESC. Генетическая мутация Rag2 затем корректируется путем гомологичной рекомбинации, и манипулируемые ntESC дифференцируются in vitro сначала в эмбриоидные тельца (EB), а затем в гемопоэтические клетки-предшественники, которые впоследствии повторно вводятся в исходный Rag2 - / - мышей, чтобы вылечить их.

В будущем будет важно производить плюрипотентные ntESCs из ядер людей, пораженных различными генетическими нарушениями человека, и использовать эти плюрипотентные линии для изучения развития и патогенеза этих заболеваний in vitro . Одиннадцать человеческих линий ESC были недавно созданы путем ядерного переноса клеток кожи, полученных от людей с заболеванием или травмой, в донорские ооциты 12 . Кроме того, недавние исследования показывают, что человеческие ESCs, слитые с соматическими фибробластами, могут репрограммировать ядра фибробластов и делать клетки плюрипотентными 13 .

Взрослые стволовые клетки от скамейки к постели

Большинство, если не все, взрослые ткани служат резервуарами стволовых клеток для восполнения клеток, которые теряются в результате повреждения ткани или гомеостаза. Каждый раз, когда образуется легкая рана, взрослые стволовые клетки (ASC) вступают в действие: стволовые клетки волосяного фолликула восстанавливают поврежденный эпидермис и волосяные фолликулы, а HSC восполняют потерянную кровь. ASC используются редко и обычно спрятаны в защищенных нишах, где они существуют в виде неподвижных, недифференцированных и недостаточно представленных компонентов ткани 14 .Выделение и характеристика ASCs создают проблемы не только из-за их статуса меньшинства, но также из-за нехватки определения маркеров клеточной поверхности.

Первыми мультипотентными ASC, которые были очищены и охарактеризованы, были HSC, расположенные в костном мозге мышей 15 . Эти ASC могут восстанавливать гематолимфоидную систему смертельно облученных мышей 16 . Присутствие HSC в костном мозге мышей и людей позволило использовать трансплантаты костного мозга в качестве терапии для лечения людей с апластической анемией, лейкемиями 17 , солидными опухолями, иммунодефицитом и нарушениями гемоглобина.

В последующие годы другие кандидаты ASC были определены только временно по их анатомическим характеристикам и свойствам медленного цикла. Эти кандидаты включают мышечные сателлитные клетки, которые присутствуют под базальной пластинкой зрелых мышечных волокон 18 ; эпителиальные стволовые клетки кожи, которые находятся под сальной железой в волосяном фолликуле в области, известной как «выпуклость» 19 ; стволовые клетки кишечника, расположенные у основания крипт кишечника 20 ; сердечные стволовые клетки 21 , 22 ; стволовые клетки нервного гребня 23 , 24 ; и бронхоальвеолярные стволовые клетки в легком 25 .

ASC обеспечивают возможность коррекции дефектных тканей и органов с помощью аутологичных методов лечения, которые устраняют риск отторжения трансплантата. Подобно стратегиям, основанным на ESC, описанным выше, существует множество моделей заболевания на мышах, показывающих, что после ex vivo генетической модификации аутологичные HSCs могут восстанавливать специфический дефект в гемопоэтическом клоне. Такие исследования сыграли важную роль в разработке и совершенствовании методов лечения различных гематологических заболеваний человека, включая рак ().

Другим вариантом лечения некоторых заболеваний является введение и экспрессия рекомбинантных генов в соматических клетках (, т.е. , генная терапия) с использованием вирусных и невирусных векторов. Среди самых продолжительных и широко освещаемых исследований - исследования, направленные на детей, страдающих тяжелыми комбинированными иммунодефицитами, в которых задерживается дифференцировка Т-клеток 26 . Существует десять генетически различных типов тяжелого комбинированного иммунодефицита, каждый из которых приводит к преждевременной смерти при отсутствии терапии.Предварительные результаты генной терапии с использованием аллогенных HSC казались очень многообещающими, потому что многие люди ответили хорошо. Однако впоследствии у 3 человек из исследования, в котором участвовало около 13 человек, развился Т-клеточный лейкоз. Главный риск, связанный с опосредованным ретровирусом переносом гена, - это случайное внедрение ретровируса в протоонкогены генома. Действительно, лейкозные клетки, выделенные от пораженных людей, содержали вирусную вставку рядом с онкогеном, который, как известно, активируется хромосомной транслокацией 27 .

Одновременно с разработкой HSC для лечения иммунодефицитных расстройств появились эпидермальные стволовые клетки для лечения пациентов с тяжелыми ожогами 28 . В исследованиях, предшествовавших испытаниям на людях, мышей с ослабленным иммунитетом использовали в качестве заменителей культивированных трансплантатов эпидермальных клеток, которые производили и поддерживали здоровый участок эпидермиса человека. Хотя кожа, полученная из культивированных эпидермальных трансплантатов, не потеет и не образует волос, она спасает жизни людей с ожогами и до сих пор используется во многих странах.

После почти двух десятилетий дальнейших обширных исследований на мышах исследователи недавно разработали методы выделения и характеристики мультипотентных стволовых клеток из волосяного фолликула 29 - 31 . Одна из стратегий заключалась в выделении стволовых клеток на основе их характеристик медленного цикла и их экспрессии флуоресцентно меченного трансгена 31 . Чтобы создать универсальную модель для выделения редко циклических клеток, была сконструирована трансгенная мышь, в которой экспрессия гистона h3B, меченного зеленым флуоресцентным белком (GFP), находится под контролем регулирующего элемента, реагирующего на тетрациклин (TRE).Эта мышь может быть скрещена с любой трансгенной мышью, экспрессирующей TRE-связывающий репрессор транскрипции (отключенный тетрациклин) под контролем промотора, специфичного для любого типа клеток. Для тестирования модели промотор кератина-5 использовался для нацеливания выключенного тетрациклина на кератиноциты кожи и других многослойных эпителиальных тканей 31 . При введении доксициклина мышам с пищей экспрессия h3B-GFP была отключена, так что через 4–8 недель только редко повторяющиеся стволовые клетки сохраняли метку.Затем для выделения стволовых клеток использовали сортировку клеток, активируемую флуоресценцией.

В ситуациях, когда мало что известно об ASC ткани и, в частности, когда не были идентифицированы диагностические маркеры клеточной поверхности, модель TRE-h3B-GFP может быть полезна, если подходящий промотор для отключения тетрациклина доступный. Идентификация, очистка и мониторинг клеток с медленным циклом, сохраняющих метку, позволят исследовать степень, в которой клетки могут быть стволовыми.В экспериментах по приживлению кератиноцитов, культивируемых из одной стволовой клетки фолликула, могут образовываться участки флуоресцентного эпидермиса, сальных желез и волос на бестимусных мышах, в остальном голых 29 . Хотя еще слишком рано судить о том, будет ли технология восстановления волос на спине голой мыши превратиться в клиническое лечение заболеваний человеческого волоса, способность определять профиль транскрипции этих клеток открывает путь к выяснению механизмов путем эпителиальные стволовые клетки кожи могут реагировать на внешние сигналы, чтобы вызвать новый виток роста волос.

Успехи в переводе ASC в клинику активизировали поиск ASC в других тканях. Этот интерес был частично вызван этическими противоречиями вокруг потенциального использования ESC в терапии заболеваний человека. Однако, когда дело доходит до лечения заболевания определенного типа клеток, соответствующий ASC может быть полезен из-за его более ограниченного потенциала, при условии, что его можно культивировать in vitro, и уговорить следовать определенной линии.Хотя очень немногие ASC были успешно размножены in vitro , доступность транскрипционных профилей многих ASC определила их репертуар рецепторов клеточной поверхности, что может помочь улучшить условия культивирования в будущем.

Какие еще ASC находятся на горизонте? Мультипотентные клетки нервной ткани из головного мозга взрослой мыши были очищены и могут делиться и давать как нейроны, так и глиальные клетки в культуре 24 , 32 .Кроме того, трансплантация обогащенных нервных популяций показала клиническую полезность при лечении одноклеточных неврологических расстройств, таких как болезнь Паркинсона, которая вызывается деградацией дофаминергических нейронов в полосатом теле 33 . Однако выживаемость привитых дофаминергических нейронов, полученных из расширенного предшественника, низкая (3–5%), что указывает на необходимость повышения выживаемости клеток после трансплантации.

Поджелудочная железа показывает ограниченный клеточный оборот, и был предложен эндогенный источник стволовых клеток для регенерации инсулин-секретирующих клеток поджелудочной железы 34 .Поджелудочная железа содержит островки, секретирующие инсулин, которые регулируют уровень глюкозы у человека и разрушаются аутоиммунной атакой при диабете 1 типа. Поскольку пополнение популяций β-клеток поджелудочной железы сопровождается секрецией эндогенного инсулина, выделение стволовых клеток поджелудочной железы, которые могут продуцировать новые β-клетки, может привести к излечению от диабета 1 типа. Однако недавняя работа показывает на мышах, что уже существующие β-клетки, а не мультипотентные стволовые клетки, являются основным источником новых β-клеток во взрослой жизни и после панкреатэктомии 35 .Эта работа предполагает, что дифференцированные клетки ткани могут сохранять пролиферативную способность in vivo.

Скелетные мышцы представляют собой интересный пример для биологов, которые традиционно ищут стволовые клетки в определенной нише или резервуаре. Митотически покоящиеся миогенные предшественники называются сателлитными стволовыми клетками. Несмотря на то, что сателлитные стволовые клетки привлекли к себе большое внимание при лечении людей, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна, функциональные свойства этих мышечных стволовых клеток остаются неясными.Клональная популяция мышечных клеток-предшественников была идентифицирована и после внутримышечной или внутривенной инъекции приводит к регенерации мышц и частичному восстановлению дистрофина у мышей mdx , модели мышечной дистрофии Дюшенна 36 . После внутриартериальной инъекции изолированные мышечные предшественники, по-видимому, приживают дистрофические мышцы мышей и участвуют в регенерации после повреждения мышц 37 , 38 . Остается неясным, представляют ли какие-либо из этих культивируемых клеток чистый пул стволовых клеток; тем не менее, линии миогенных клеток могут быть полезны в качестве источника миогенных предшественников для прямой или системной трансплантации.

Анализ свойств предполагаемых генов стволовых клеток

С появлением технологии массивов генов молекулярная характеристика стволовых клеток сделала шаг вперед, предоставив исчерпывающие снимки транскрипционных профилей этих клеток. Этот прогресс побудил исследователей обратиться к некоторым фундаментальным вопросам биологии стволовых клеток. Являются ли определенные особенности общими для всех стволовых клеток? Чем ASC отличаются от ESC? Какие молекулярные механизмы контролируют состояние покоя стволовых клеток и их способность к самообновлению? И как стволовые клетки активируются при их превращении из неподвижной мультипотентной клетки в коммитированную клетку, которая временно делится и дифференцируется по определенному клону?

Две основные проблемы стоят перед исследователями, пытающимися использовать транскрипционный репертуар мультипотентных стволовых клеток.Первый - это разработка стратегий выделения и очистки этих второстепенных компонентов ткани; второй - выбор того, с чем сравнивать эти ячейки. В ранних исследованиях такого рода Иванова и соавт. 39 использовали маркеры клеточной поверхности и клеточную сортировку, активируемую флуоресценцией, для выделения и определения профиля транскрипции HSC и их ранних коммитированных транзиентных потомков амплификации. Рамальо-Сантос и др. 40 использовали аналогичные методы для выделения HSC, но сравнили их профили транскрипции с профилями цельного костного мозга.Несмотря на воспроизводимые данные массива для HSC, список того, что составляет «стволовость» HSC, заметно отличался в двух исследованиях. Одна группа определила гены, которые были активированы в HSC по сравнению со всей гетерогенной тканью, окружающей клетки, тогда как другая определила гены, экспрессия которых изменилась, поскольку HSCs изменили свои свойства и вступили в клон. Оба типа сравнения полезны, но они дают очень разную информацию.

Поскольку все больше стволовых клеток и их потомков выделяются и профилируются, подробные данные об экспрессии накапливаются с большой скоростью.Ученые начали пожинать плоды этих молекулярных сигнатур, более глубоко исследуя механизмы, с помощью которых стволовые клетки поддерживаются в их нишах в состоянии покоя и дифференцировки, и как они становятся мобилизованными, когда они покидают свои ниши и выбирают определенную линию.

Многие примеры показывают, как молекулярные маркеры, иногда в сочетании с моделями трансгенных и нокаутных мышей, дают представление о механизмах, лежащих в основе поддержания и самообновления стволовых клеток.Hoxb4, например, представляет собой фактор транскрипции, содержащий гомеодомен, который обнаружен в нескольких различных массивах. Hoxb4 увеличивает жизнеспособность и пролиферацию при сверхэкспрессии в мышиных HSC 41 , что, в свою очередь, дает повышенную эффективность спасения при трансплантации мышам с истощенными HSC. Другим примером является Bmi-1, член регулирующего хроматин комплекса Polycomb, который необходим для генерации самообновляющихся взрослых HSCs 42 и для самообновления нервных стволовых клеток 43 .

Не менее важны, чем факторы ремоделирования хроматина, в управлении стволовыми клетками пути передачи сигнала. Передача сигналов Wnt стала универсальным регулятором стволовых клеток, но то, как именно Wnts действуют на стволовые клетки, остается предметом интенсивных дискуссий 44 . Клетки отвечают на каноническую передачу сигналов Wnt, стабилизируя избыток β-катенина, который не используется в клеточной адгезии. Этот стабилизированный β-катенин затем может свободно связываться и действовать как транскрипционный кофактор для членов семейства ДНК-связывающих белков Lef1 или Tcf.Трансгенная сверхэкспрессия конститутивно стабилизированной версии β-catenin в эпидермисе кожи приводит к морфогенезу de novo волосяных фолликулов, что характерно для мультипотентных эмбриональных стволовых клеток кожи, но не для эпидермиса взрослых 45 . Немного более низкие уровни передачи сигналов Wnt приводят к активации ASC существующих волосяных фолликулов 46 . Напротив, мутации с потерей функции в β-catenin полностью блокируют образование волосяных фолликулов 47 . В кишечнике потеря партнера β-катенина Tcf4 блокирует образование ткани 48 .

В нервной системе трансгенная сверхэкспрессия β-катенина приводит к увеличению мозга и увеличению популяции предшественников 49 , тогда как в стволовых клетках нервного гребня стабилизированный β-катенин мало влияет на размер популяции и вместо этого регулирует решения судьбы 50 . В предшественниках костного мозга инактивация β-catenin in vivo , по-видимому, не нарушает способность этих клеток к самообновлению и воссозданию гематопоэтических клонов 51 .Но сверхэкспрессия β-катенина в культивируемых потомках изолированных HSC способствует пролиферации этих клеток, которые при введении в кровь смертельно облученных мышей, по крайней мере, поддерживают продукцию миелоидных, B- и T-клеточных линий 52 .

В то время как исследователи изучают механизмы, лежащие в основе передачи сигналов Wnt в биологии стволовых клеток, они также изучают, как другие пути могут действовать согласованно, чтобы интегрировать биологию стволовых клеток. Подобно передаче сигналов Wnt, передача сигналов Notch и костных морфогенетических белков, по-видимому, оказывает плейотропные эффекты на стволовые клетки и их клоны, и эти эффекты, по-видимому, различаются для разных стволовых клеток 53 .Остается неясным, действуют ли эти факторы на уровне самообновления стволовых клеток, активации стволовых клеток или кратковременной амплифицирующей пролиферации или дифференцировки клеток. Напр., Нарушение ткани, наблюдаемое в моделях нокаута мышей, может возникать либо из-за дефекта стволовых клеток, либо из-за неспособности пролиферировать потомство временных амплифицирующих клеток. Точно так же влияние сигнального фактора на пролиферацию культивируемых стволовых клеток может быть либо признаком повышенной пролиферации потомства временных амплифицирующих клеток в культуре, либо признаком самообновления стволовых клеток.По мере проведения будущих исследований должно стать очевидным, поддерживаются и размножаются ли стволовые клетки с помощью общего набора регуляторных путей и молекулярных принципов, или кажущееся противоположное влияние сигнальных молекул на поведение различных клеток является отражением разнообразия. ИСК.

Стволовые клетки дома

В тканях взрослых мультипотентные стволовые клетки часто спрятаны в защищенных местах или нишах. Самая защищенная ниша - это костный мозг, в котором находятся ГСК.Кожу можно микродиссектировать на единицы, в которых каждый волосяной фолликул имеет крошечную нишу (выпуклость) стволовых клеток, которые отвечают за образование новых волос во время цикла роста волос и за пополнение клеток сальной железы и эпидермиса при травмах. 54 . Точно так же кишечник состоит из сотен единиц, каждая из которых содержит ворсинки и крипту, а стволовые клетки расположены кольцом прямо над основанием крипты. Стволовые клетки в каждой крипте ответственны за создание четырех линий абсорбционных и секреторных клеток, которые составляют крипту и ворсинку 20 .В центральной нервной системе взрослого человека стволовые клетки расположены в субвентрикулярной зоне, где они могут генерировать глию и нейроны 24 .

Важность ниши лучше всего иллюстрируется экспериментами, в которых судьба ESCs отслеживается после их подкожной инъекции иммунодефицитным голым мышам. При помещении в инородную среду окружающей in vivo ткани, ESC образуют доброкачественные тератомы, которые содержат множество типов клеток 55 .Это исследование показывает важность соответствующей микросреды для конкретных межклеточных взаимодействий и клеточной организации.

Большинство стволовых клеток совершают дифференцировку по определенным линиям, когда они покидают свою нишу. ГСК кажутся исключением, потому что они могут циркулировать в кровотоке и возвращаться домой относительно невредимыми в процессе, называемом наведением 56 . Эксперименты с использованием генетически маркированных мышей с парабиотиками CD45.1 и CD45.2, которые имеют общую циркуляцию, были проведены для изучения миграции HSC из костного мозга через кровь 57 .Результаты показывают, что HSC, обнаруживаемые в периферической крови, мигрировали из своей ниши, что приводит к возможности того, что HSC, передаваемые через кровь, могут быть источником плюрипотентных или мультипотентных стволовых клеток, доступных для восстановления как негематопоэтических, так и гематопоэтических тканей 57 .

Поскольку стволовые клетки зависят от окружающей среды для поддержания своих свойств стволовых клеток, развитие ниши имеет решающее значение 14 . Внутри ниши стволовые клетки обычно поддерживают среду, препятствующую росту и дифференцировке.Каждый раз, когда стволовой клетке предлагается покинуть нишу, ее необходимо пополнять, предположительно путем самообновления. И наоборот, чтобы стволовая клетка покинула нишу и последовала определенному клону, ее микросреда должна измениться, накапливать или утратить важные факторы, которые в противном случае удерживают ее в ее нише.

Генетические исследования половых клеток Drosophila melanogaster дают лучшее представление о том, как это изменение могло произойти. 58 . Хотя исследования ниш млекопитающих отстают, недавняя характеристика и генетические манипуляции с мышиными ASC и их нишами привели к прогрессу в нашем понимании того, что составляет эту среду в биологии стволовых клеток млекопитающих.Такие исследования также дали представление о том, как ключевые сигнальные пути регулируют поведение стволовых клеток.

Среди наиболее интересных достижений в этой области - исследования глубины ниши костного мозга HSC, выстланной пространственно ориентированными остеобластами. По мере того, как HSC прогрессивно созревают, они теряют контакт с этими соседними стромальными клетками, становятся более пролиферативными, направляются в центральную полость костного мозга и проникают в кровеносные сосуды. Когда мышей генетически изменяют для увеличения популяции остеобластов на внутренней поверхности кости, количество HSC одновременно увеличивается, и способность этих новых HSC сохранять свои свойства медленного цикла, по-видимому, зависит от их способности напрямую прикрепляться к остеобластам через N-кадгерин. –Опосредованные спаечные соединения 59 .Эти исследования выявили решающую роль остеобластов в поддержании долгоживущих и наиболее ценных HSC. Данные также показывают, что по крайней мере некоторые HSC контактируют с синусоидальным эндотелием кровеносных сосудов в костном мозге, что может объяснить, почему HSC могут быть мобилизованы в кровоток с очень быстрой кинетикой 60 . Примечательно, что недавно было показано, что эмбриональные стволовые клетки кожи используют адгезивные соединения для контроля асимметричного деления клеток, что может иметь широкое значение для стволовых клеток 61 .

В заключение следует отметить, что характеристика стволовых клеток мышей и манипуляции с ними привели к широкому спектру клинических применений и многообещающим направлениям для будущих исследований. Внедряя эту мощную технологию из области моделей мышей в клинические условия, ученым всего мира необходимо будет разработать руководящие принципы, которые сбалансируют моральные и этические соображения с пользой для терапевтической медицины. При этом ответственность за эффективное общение и убеждение общественности в важности продвижения вперед лежит на ученых.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарим M. Schober, V. Horsley и C. Blanpain за обсуждения и советы во время подготовки этого обзора. Г.Г. является получателем программы Human Frontier Science Programme. E.F. - исследователь Медицинского института Говарда Хьюза и получатель финансирования от Национальных институтов здравоохранения США.

Ссылки

1. Evans MJ, Kaufman MH. Создание в культуре плюрипотенциальных клеток из эмбрионов мыши. Природа. 1981; 292: 154–156. [PubMed] [Google Scholar] 2.Мартин ГР. Выделение линии плюрипотентных клеток из ранних эмбрионов мыши, культивированных в среде, кондиционированной стволовыми клетками тератокарциномы. Proc. Natl. Акад. Sci. США. 1981; 78: 7634–7638. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 3. Брэдли А., Эванс М., Кауфман М. Х., Робертсон Э. Формирование химер зародышевой линии из клеточных линий тератокарциномы, полученных из эмбрионов. Природа. 1984. 309: 255–256. [PubMed] [Google Scholar] 4. Клуг MG, Soonpaa MH, Koh GY, Field LJ. Генетически отобранные кардиомиоциты из дифференцирующихся эмбриональных стволовых клеток образуют стабильные внутрисердечные трансплантаты.J. Clin. Вкладывать деньги. 1996. 98: 216–224. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 5. Ким Дж. Х. и др. Дофаминовые нейроны, полученные из эмбриональных стволовых клеток, функционируют в животной модели болезни Паркинсона. Природа. 2002; 418: 50–56. [PubMed] [Google Scholar] 6. Brustle O и др. Глиальные предшественники, полученные из эмбриональных стволовых клеток: источник миелинизирующих трансплантатов. Наука. 1999. 285: 754–756. [PubMed] [Google Scholar] 7. Chinzei R, et al. Клетки эмбриональных тельцов, полученные из линии эмбриональных стволовых клеток мыши, дифференцируются в функциональные гепатоциты.Гепатология. 2002; 36: 22–29. [PubMed] [Google Scholar] 8. Hochedlinger K, Jaenisch R. Моноклональные мыши, полученные путем переноса ядра из зрелых B- и T-донорных клеток. Природа. 2002; 415: 1035–1038. [PubMed] [Google Scholar] 9. Вакаяма Т. и др. Дифференциация линий эмбриональных стволовых клеток, полученных из взрослых соматических клеток путем переноса ядра. Наука. 2001; 292: 740–743. [PubMed] [Google Scholar] 10. Rideout WM, III, Hochedlinger K, Kyba M, Daley GQ, Jaenisch R. Исправление генетического дефекта с помощью ядерной трансплантации и комбинированной клеточной и генной терапии.Клетка. 2002; 109: 17–27. [PubMed] [Google Scholar] 11. Барбери Т. и др. Спецификация нейронного подтипа эмбриональных стволовых клеток при оплодотворении и переносе ядра и применение у мышей с паркинсонизмом. Nat. Biotechnol. 2003. 21: 1200–1207. [PubMed] [Google Scholar] 12. Hwang WS и др. Эмбриональные стволовые клетки, специфичные для пациента, полученные из бластоцист SCNT человека. Наука. 2005; 308: 1777–1783. [PubMed] [Google Scholar] 13. Cowan CA, Atienza J, Melton DA, Eggan K. Ядерное перепрограммирование соматических клеток после слияния с человеческими эмбриональными стволовыми клетками.Наука. 2005; 309: 1369–1373. [PubMed] [Google Scholar] 14. Фукс Э., Тумбар Т., Гуаш Г. Общение с соседями: стволовые клетки и их ниша. Клетка. 2004. 116: 769–778. [PubMed] [Google Scholar] 15. Spangrude GJ, Heimfeld S, Weissman IL. Очистка и характеристика гемопоэтических стволовых клеток мыши. Наука. 1988. 241: 58–62. [PubMed] [Google Scholar] 16. Ford CE, Hamerton JL, Barnes DW, Loutit JF. Цитологическая идентификация радиационных химер. Природа. 1956; 177: 452–454. [PubMed] [Google Scholar] 17.Бакнер CD и др. Аллогенное приживление костного мозга после облучения всего тела у пациента с лейкемией. Кровь. 1970; 35: 741–750. [PubMed] [Google Scholar] 18. Сил П., Асакура А., Рудницкий М.А. Потенциал мышечных стволовых клеток. Dev. Клетка. 2001; 1: 333–342. [PubMed] [Google Scholar] 19. Cotsarelis G, Sun TT, Lavker RM. Клетки, сохраняющие метку, находятся в области выпуклости волосистой части тела: это влияет на фолликулярные стволовые клетки, цикл роста волос и канцерогенез кожи. Клетка. 1990; 61: 1329–1337. [PubMed] [Google Scholar] 20.Loeffler M, Birke A, Winton D, Potten C. Соматические мутации, моноклональность и стохастические модели организации стволовых клеток в кишечном крипте. J. Theor. Биол. 1993; 160: 471–491. [PubMed] [Google Scholar] 21. Бельтрами А.П. и др. Взрослые кардиальные стволовые клетки мультипотентны и поддерживают регенерацию миокарда. Клетка. 2003. 114: 763–776. [PubMed] [Google Scholar] 23. Buchstaller J, et al. Эффективное выделение и профилирование экспрессии генов небольшого количества стволовых клеток нервного гребня и развивающихся шванновских клеток.J. Neurosci. 2004. 24: 2357–2365. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 24. Doetsch F, Caille I, Lim DA, Garcia-Verdugo JM, Alvarez-Buylla A. Астроциты субвентрикулярной зоны представляют собой нервные стволовые клетки в мозге взрослых млекопитающих. Клетка. 1999; 97: 703–716. [PubMed] [Google Scholar] 25. Kim CF, et al. Идентификация бронхоальвеолярных стволовых клеток при нормальном раке легких и легких. Клетка. 2005; 121: 823–835. [PubMed] [Google Scholar] 26. Cavazzana-Calvo M, et al. Генная терапия тяжелого комбинированного иммунодефицита человека (SCID) -X1 болезни.Наука. 2000. 288: 669–672. [PubMed] [Google Scholar] 27. Hacein-Bey-Abina S, et al. LMO2-ассоциированная пролиферация клональных Т-клеток у двух пациентов после генной терапии SCID-X1. Наука. 2003. 302: 415–419. [PubMed] [Google Scholar] 28. Gallico GG, III, O'Connor NE, Compton CC, Kehinde O, Green H. Постоянное покрытие больших ожоговых ран аутологичным культивированным эпителием человека. N. Engl. J. Med. 1984; 311: 448–451. [PubMed] [Google Scholar] 29. Blanpain C, Lowry WE, Geoghegan A, Polak L, Fuchs E. Самообновление, мультипотентность и существование двух популяций клеток в нише эпителиальных стволовых клеток.Клетка. 2004. 118: 635–648. [PubMed] [Google Scholar] 30. Моррис Р.Дж. и др. Захват и профилирование стволовых клеток взрослых волосяных фолликулов. Nat. Biotechnol. 2004; 22: 411–417. [PubMed] [Google Scholar] 32. Rietze RL, et al. Очистка плюрипотентных нервных стволовых клеток из мозга взрослой мыши. Природа. 2001; 412: 736–739. [PubMed] [Google Scholar] 33. Studer L, Tabar V, McKay RD. Трансплантация расширенных предшественников мезэнцефалита приводит к выздоровлению крыс с паркинсонизмом. Nat. Neurosci. 1998; 1: 290–295. [PubMed] [Google Scholar] 34.Сиберг Р.М. и др. Клональная идентификация мультипотентных предшественников из поджелудочной железы взрослых мышей, которые генерируют нервные и панкреатические клоны. Nat. Biotechnol. 2004. 22: 1115–1124. [PubMed] [Google Scholar] 35. Дор Й, Браун Дж, Мартинес О.И., Мелтон Д.А. Взрослые β-клетки поджелудочной железы образуются путем самодублирования, а не дифференцировки стволовых клеток. Природа. 2004; 429: 41–46. [PubMed] [Google Scholar] 36. Ли JY и др. Клональная изоляция мышечных клеток, способных улучшить регенерацию мышц и заживление костей.J. Cell Biol. 2000; 150: 1085–1100. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 37. Torrente Y, et al. Внутриартериальная инъекция мышечных стволовых клеток CD34 + Sca-1 + восстанавливает дистрофин у мышей mdx . J. Cell Biol. 2001. 152: 335–348. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 38. Collins CA, et al. Функция стволовых клеток, самообновление и поведенческая неоднородность клеток из ниши взрослых мышечных сателлитных клеток. Клетка. 2005; 122: 289–301. [PubMed] [Google Scholar] 39.Иванова Н.Б., и др. Молекулярная сигнатура стволовых клеток. Наука. 2002; 298: 601–604. [PubMed] [Google Scholar] 40. Рамальо-Сантос М., Юн С., Мацузаки Ю., Маллиган Р.С., Мелтон Д.А. «Стебель»: профили транскрипции эмбриональных и взрослых стволовых клеток. Наука. 2002; 298: 597–600. [PubMed] [Google Scholar] 41. Антончук Дж., Соважо Дж., Хамфрис РК. HOXB4-индуцированная экспансия взрослых гемопоэтических стволовых клеток ex vivo . Клетка. 2002; 109: 39–45. [PubMed] [Google Scholar] 42. Парк И.К. и др. Bmi-1 необходим для поддержания самообновляющихся гемопоэтических стволовых клеток взрослых.Природа. 2003; 423: 302–305. [PubMed] [Google Scholar] 43. Молофский А.В., и др. Зависимость от Bmi-1 отличает самообновление нервных стволовых клеток от пролиферации предшественников. Природа. 2003; 425: 962–967. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 44. Клебер М., Соммер Л. Передача сигналов Wnt и регуляция функции стволовых клеток. Curr. Opin. Cell Biol. 2004. 16: 681–687. [PubMed] [Google Scholar] 45. Gat U, DasGupta R, Degenstein L, Fuchs E. De novo Морфогенез волосяного фолликула и опухоли волос у мышей, экспрессирующих усеченный β-катенин в коже.Клетка. 1998. 95: 605–614. [PubMed] [Google Scholar] 47. Huelsken J, Vogel R, Erdmann B, Cotsarelis G, Birchmeier W. β-Катенин контролирует морфогенез волосяного фолликула и дифференцировку стволовых клеток в коже. Клетка. 2001; 105: 533–545. [PubMed] [Google Scholar] 48. Коринек В. и др. Истощение компартментов эпителиальных стволовых клеток в тонком кишечнике мышей, лишенных Tcf-4. Nat. Genet. 1998. 19: 379–383. [PubMed] [Google Scholar] 49. Ченн А., Уолш, Калифорния. Регулирование размера коры головного мозга путем контроля выхода из клеточного цикла в нервных предшественниках.Наука. 2002. 297: 365–369. [PubMed] [Google Scholar] 50. Ли Х.Й. и др. Инструктивная роль Wnt / β-catenin в спецификации сенсорной судьбы в стволовых клетках нервного гребня. Наука. 2004. 303: 1020–1023. [PubMed] [Google Scholar] 52. Рейя Т. и др. Роль передачи сигналов Wnt в самообновлении гемопоэтических стволовых клеток. Природа. 2003; 423: 409–414. [PubMed] [Google Scholar] 53. Дункан А.В. и др. Интеграция передачи сигналов Notch и Wnt в поддержание гемопоэтических стволовых клеток. Nat. Иммунол. 2005. 6: 314–322. [PubMed] [Google Scholar] 54.Осима Х., Рочат А., Кедзия С., Кобаяши К., Баррандон Ю. Морфогенез и обновление волосяных фолликулов из взрослых мультипотентных стволовых клеток. Клетка. 2001; 104: 233–245. [PubMed] [Google Scholar] 55. Томсон Дж. А. и др. Линии эмбриональных стволовых клеток, полученные из бластоцист человека. Наука. 1998. 282: 1145–1147. [PubMed] [Google Scholar] 56. Quesenberry PJ, Colvin G, Abedi M. Перспектива: фундаментальные и клинические концепции самонаведения и приживления стволовых клеток: путешествие в ниши и за их пределы. Exp. Гематол. 2005; 33: 9–19.[PubMed] [Google Scholar] 57. Райт Д.Е., Уэйджерс А.Дж., Гулати А.П., Джонсон, Флорида, Вайсман, Иллинойс. Физиологическая миграция гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников. Наука. 2001; 294: 1933–1936. [PubMed] [Google Scholar] 58. Ямасита Ю.М., Фуллер М.Т., Джонс Д.Л. Передача сигналов в нишах стволовых клеток: уроки зародышевой линии Drosophila . J. Cell Sci. 2005. 118: 665–672. [PubMed] [Google Scholar] 59. Чжан Дж. И др. Идентификация ниши гемопоэтических стволовых клеток и контроль размера ниши. Природа. 2003; 425: 836–841.[PubMed] [Google Scholar] 60. Киль MJ и др. Рецепторы семейства SLAM различают гемопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники и выявляют эндотелиальные ниши для стволовых клеток. Клетка. 2005; 121: 1109–1121. [PubMed] [Google Scholar] 61. Lechler T, Fuchs E. Асимметричные деления клеток способствуют расслоению и дифференцировке кожи млекопитающих. Природа. 2005; 437: 275–280. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 62. Гудман Дж. В., Ходжсон Г. С.. Доказательства наличия стволовых клеток в периферической крови мышей. Кровь. 1962; 19: 702–714.[PubMed] [Google Scholar] 63. Flanagan SP. «Nude», новый ген безволосости с плейотропными эффектами у мышей. Genet. Res. 1966; 8: 295–309. [PubMed] [Google Scholar] 64. Харрисон DE. Конкурентная репопуляция: новый анализ долгосрочной функциональной способности стволовых клеток. Кровь. 1980; 55: 77–81. [PubMed] [Google Scholar] 65. Томас KR, Капеччи MR. Сайт-направленный мутагенез путем нацеливания на ген в стволовых клетках, полученных из эмбрионов мыши. Клетка. 1987. 51: 503–512. [PubMed] [Google Scholar] 66. МакКьюн Дж. М. и др. Мышь SCID-hu: мышиная модель для анализа дифференцировки и функции гематолимфоидов человека.Наука. 1988; 241: 1632–1639. [PubMed] [Google Scholar] 67. Томпсон С., Кларк А. Р., Пау А. М., Хупер М. Л., Мелтон Д. В.. Передача по зародышевой линии и экспрессия скорректированного гена HPRT, продуцируемого нацеливанием гена в эмбриональных стволовых клетках. Клетка. 1989; 56: 313–321. [PubMed] [Google Scholar] 68. Любин И. и др. Приживление и развитие человеческих Т- и В-клеток у мышей после трансплантации костного мозга. Наука. 1991; 252: 427–431. [PubMed] [Google Scholar] 69. Shinkai Y, et al. У мышей с дефицитом RAG-2 отсутствуют зрелые лимфоциты из-за неспособности инициировать перестройку V (D) J.Клетка. 1992. 68: 855–867. [PubMed] [Google Scholar] 70. Кэмпбелл К.Х., МакВир Дж., Ричи В.А., Уилмут И. Овцы, клонированные путем переноса ядра из культивируемой клеточной линии. Природа. 1996. 380: 64–66. [PubMed] [Google Scholar] 71. Томсон Дж. А. и др. Линии эмбриональных стволовых клеток, полученные из бластоцист человека. Наука. 1998. 282: 1145–1147. [PubMed] [Google Scholar] 72. Munsie MJ, et al. Выделение плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток из перепрограммированных ядер соматических клеток взрослых мышей. Curr. Биол. 2000; 10: 989–992. [PubMed] [Google Scholar] 73.Динсмор Дж. И др. Эмбриональные стволовые клетки дифференцировали in vitro и как новый источник клеток для трансплантации. Трансплантация клеток. 1996. 5: 131–143. [PubMed] [Google Scholar] 74. Ямамото Х. и др. Дифференциация эмбриональных стволовых клеток в гепатоциты: биологические функции и терапевтическое применение. Гепатология. 2003; 37: 983–993. [PubMed] [Google Scholar] 75. Мин JY и др. Трансплантация эмбриональных стволовых клеток улучшает сердечную функцию у постинфарктных крыс. J. Appl. Physiol. 2002. 92: 288–296.[PubMed] [Google Scholar]

мышей в мире биологии стволовых клеток

Nat Genet. Авторская рукопись; доступно в PMC 2008 30 мая.

Опубликован в окончательной редакции как:

PMCID: PMC2405927

NIHMSID: NIHMS44874

Медицинский институт Говарда Хьюза, Университет Рокфеллера, Лаборатория клеточной биологии и развития млекопитающих Йорк, 1230 Box 300, Нью-Йорк, Нью-Йорк 10021, США.

Окончательная отредактированная версия этой статьи издателем доступна на сайте Nat Genet. См. Другие статьи в PMC, в которых цитируется опубликованная статья.

Abstract

Способность эмбрионов к разнообразию и некоторых взрослых тканей к регенерации на протяжении всей жизни напрямую связана со стволовыми клетками. Эти клетки обладают способностью к самообновлению, то есть к делению и созданию дополнительных стволовых клеток, а также к дифференцировке по определенной линии. Дифференциация плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток по определенным клеточным линиям используется для понимания молекулярных механизмов, участвующих в развитии тканей. Часто безграничная способность эмбриональных стволовых клеток генерировать дифференцированные типы клеток позиционирует область стволовых клеток на стыке между биологами развития, которые очарованы свойствами этих клеток, и клиницистами, которые воодушевлены перспективами получения стволовых клеток из скамейка у постели больного для лечения дегенеративных заболеваний и травм, от которых в настоящее время нет лекарств.Здесь мы подчеркиваем важность мышей в биологии стволовых клеток и в том, чтобы сделать мир еще на шаг ближе к тому, чтобы увидеть, как эти клетки воплощаются в жизнь в современной медицине.

Эмбриональные стволовые клетки как источник для заместительной клеточной терапии

Эмбриональные стволовые клетки мыши (ESC) были впервые выделены с помощью in vitro культуры клеток, выделенных из внутренней клеточной массы (ICM) ранних эмбрионов или бластоцист 1 , 2 (). В соответствующих условиях культивирования ESC могут пролиферировать бесконечно долго, сохраняя при этом способность дифференцироваться во все типы соматических клеток ().Когда культивируемые ESC вводятся в ICM эмбрионов мыши, которые затем переносятся в маточный проток приемной матери-мыши, полученное потомство имеет химерные ткани и органы, состоящие из клеток, которые происходят частично из ESC, а частично из ICM. Поскольку происходящие из ESC половые клетки также присутствуют у химерных мышей-основателей, это мощный подход для внесения специфических генетических изменений в зародышевую линию мыши 3 .

Хронология основных открытий в исследовании стволовых клеток мышей.Показаны многие важные открытия, сделанные за последние 50 лет, когда исследователи использовали мышей в качестве модельных систем для создания основ биологии стволовых клеток. Эта работа имела фундаментальное значение для внедрения исследований стволовых клеток в клинические условия. LT-HSC, долгосрочные HSC; SCID-Hu, тяжелый комбинированный иммунодефицит человека.

Coaxing ESCs down отборные линии для терапевтического применения при травмах и дегенеративных расстройствах. Зиготы и их ранние клеточные деления вплоть до стадии морулы определяются как тотипотентные, потому что они могут генерировать целую мышь.На стадии бластоцисты только клетки ICM сохраняют способность генерировать все три первичных зародышевых листка (эктодерма, мезодерма и энтодерма), которые развиваются в органы и ткани тела. ESCs, культивируемые из ICM бластоцисты, можно дифференцировать in vitro и как эмбриоидные тельца. При правильном сочетании факторов роста эти эмбриоидные тела могут дифференцироваться в различные типы клеток. Полученные дифференцированные клетки мыши, полученные из ESC, были использованы в экспериментах по трансплантации на моделях грызунов при травмах и дегенеративных нарушениях.BMP4, костный морфогенетический белок 4; Db-CAMP, дибутирилциклический AMP; EGF, фактор роста эпидермиса; ЭПО, эритропоэтин; FGF2, фактор роста фибробластов 2; ИЛ, интерлейкин; M-CSF, колониестимулирующий фактор макрофагов; PDGF, фактор роста тромбоцитов; РА, ретиноевая кислота; Т3, трийодтиронин.

В нынешнюю эпоху «регенеративной медицины» ученые сейчас сосредоточены на оптимизации условий культивирования, необходимых для того, чтобы заставить культивируемые ЭСК дифференцироваться в определенные типы клеток, такие как сердечные, нервные или эндокринные клоны ().Если желаемый тип клеток может быть произведен в массовом порядке как чистая популяция in vitro , клетки можно протестировать на их способность к репопуляции и восстановлению поврежденных или дегенерирующих тканей. Новые результаты, полученные на мышиных моделях с использованием клоноспецифичных клеток, полученных из ESC, являются многообещающими и предполагают, что заместительная терапия на основе ESC может быть применима для лечения дегенеративных заболеваний человека, связанных с потерей или уменьшением пула определенного типа клеток.

Потенциал терапии стволовыми клетками распространяется на многие заболевания, включая инфаркт миокарда 4 , болезнь Паркинсона 5 , болезнь миелина 6 и печеночную недостаточность 7 ().Многие исследования на мышах, включающие регенеративную терапию с использованием клеток, полученных из ESC, находятся на предварительной стадии, и в большинстве случаев возможность долгосрочного выживания мышей или осложняющих побочных эффектов подробно не анализировалась. Но достигнутые к настоящему времени успехи вдохновляют и предполагают, что технологии, относящиеся к регенеративной терапии на основе ESC, могут быть полезны в клинических условиях.

Перенос ядра соматических клеток

Одной из самых серьезных проблем в использовании клинического потенциала ЭСК является устранение иммунологических барьеров для трансплантации тканей, полученных из ЭСК человека.Использование геномной замены, известной как перенос ядра соматической клетки, предлагает возможное решение иммунного отторжения тканеспецифичных популяций клеток, полученных в результате дифференцировки чужеродных ЭСК. Репрограммированная терапия соматических клеток, называемая терапевтическим клонированием, использует эту технологию для введения ядра взрослой донорской клетки (, например, , ядро ​​В- или Т-лимфоцита 8 ) в энуклеированный ЭСК хозяина для создания гибридной линии ЭСК. Теперь адаптированная для генетического соответствия донору, эта линия ESC может быть дифференцирована в выбранный тип клеток и использована в регенеративной трансплантации для лечения пораженного человека.Одна из проблем заключается в том, что митохондриальный геном по-прежнему будет происходить из исходной линии ESC, и поэтому «чужие» митохондриальные белки будут производиться этими клетками. Исследования на мышах будут полезны для более подробного изучения того, в какой степени эти чужеродные белки могут вызывать иммунную реакцию. Такие исследования станут предпосылкой для применения этой технологии в медицине.

Если отбросить эти оговорки, насколько хорошо работает технология передачи ядер? До сих пор большинство исследований было сосредоточено на переносе ядер от соматических клеток в яйца мыши.Этот метод производит гибридные ESC, называемые ESC с переносом ядра (ntESC), которые затем вводятся в ICM бластоцисты хозяина для создания «клонированной» мыши, а не используются для дифференциации и регенеративной терапии. Клонированные мыши были созданы с помощью этого подхода, что указывает на то, что необходимые технические манипуляции могут быть выполнены без нарушения способности ntESC генерировать все ткани и органы мыши 9 . Что до сих пор модели мышей говорили нам об обещаниях и подводных камнях?

В особенно творческом примере Rideout et al. 10 сочетали терапевтическое клонирование с генной терапией для исправления генетического дефекта в иммунной системе (). В этом подходе перенос ядра был впервые использован для создания ntESC, несущих мутацию в гене, кодирующем рекомбиназу Rag2, который необходим для развития B- и T-клеток. Затем гомологичная рекомбинация была использована для исправления дефекта в Rag2 в культивируемых ntESC. После их восстановления ntESC были использованы для создания мышей, которые показали полное восстановление иммунной функции.Возможно, даже более важным для терапевтического клонирования является то, что репарированные ESC дифференцировались в культуре с образованием гемопоэтических стволовых клеток (HSC), которые затем, как было показано, спасали, по крайней мере частично, облученных Rag2 - / - мышей 10 . Эта работа представляет собой доказательство принципа использования терапии ядерным переносом соматических клеток для лечения генетического заболевания. Неожиданно, однако, первоначальные попытки приживления этих клеток потерпели неудачу из-за увеличения естественных клеток-киллеров.В этом отношении более многообещающие результаты были получены с дифференцировкой ntESCs в определенный тип клеток, который не имеет множества вариантов, переданных стволовым клеткам, включая HSCs. Например, трансплантация дофаминергических нейронов, происходящих из ntESC, по-видимому, корректирует фенотип мышиной модели болезни Паркинсона 11 .

Генная терапия в сочетании с терапевтическим клонированием. Схема эксперимента Rideout et al. 10 , которые использовали технологию ESC и генную терапию для исправления генетических дефектов в системе кроветворения.Клеточные культуры сначала получают из кончиков хвостов иммунодефицитных мышей, гомозиготных по нокаутной мутации в Rag2 . Затем ядра из этих клеток переносятся в энуклеированные ооциты, выделенные от нормальной мыши. Полученные гибридные клетки культивируют и вводят в ICM бластоцист мыши для получения Rag2 - / - ESC или ntESC. Генетическая мутация Rag2 затем корректируется путем гомологичной рекомбинации, и манипулируемые ntESC дифференцируются in vitro сначала в эмбриоидные тельца (EB), а затем в гемопоэтические клетки-предшественники, которые впоследствии повторно вводятся в исходный Rag2 - / - мышей, чтобы вылечить их.

В будущем будет важно производить плюрипотентные ntESCs из ядер людей, пораженных различными генетическими нарушениями человека, и использовать эти плюрипотентные линии для изучения развития и патогенеза этих заболеваний in vitro . Одиннадцать человеческих линий ESC были недавно созданы путем ядерного переноса клеток кожи, полученных от людей с заболеванием или травмой, в донорские ооциты 12 . Кроме того, недавние исследования показывают, что человеческие ESCs, слитые с соматическими фибробластами, могут репрограммировать ядра фибробластов и делать клетки плюрипотентными 13 .

Взрослые стволовые клетки от скамейки к постели

Большинство, если не все, взрослые ткани служат резервуарами стволовых клеток для восполнения клеток, которые теряются в результате повреждения ткани или гомеостаза. Каждый раз, когда образуется легкая рана, взрослые стволовые клетки (ASC) вступают в действие: стволовые клетки волосяного фолликула восстанавливают поврежденный эпидермис и волосяные фолликулы, а HSC восполняют потерянную кровь. ASC используются редко и обычно спрятаны в защищенных нишах, где они существуют в виде неподвижных, недифференцированных и недостаточно представленных компонентов ткани 14 .Выделение и характеристика ASCs создают проблемы не только из-за их статуса меньшинства, но также из-за нехватки определения маркеров клеточной поверхности.

Первыми мультипотентными ASC, которые были очищены и охарактеризованы, были HSC, расположенные в костном мозге мышей 15 . Эти ASC могут восстанавливать гематолимфоидную систему смертельно облученных мышей 16 . Присутствие HSC в костном мозге мышей и людей позволило использовать трансплантаты костного мозга в качестве терапии для лечения людей с апластической анемией, лейкемиями 17 , солидными опухолями, иммунодефицитом и нарушениями гемоглобина.

В последующие годы другие кандидаты ASC были определены только временно по их анатомическим характеристикам и свойствам медленного цикла. Эти кандидаты включают мышечные сателлитные клетки, которые присутствуют под базальной пластинкой зрелых мышечных волокон 18 ; эпителиальные стволовые клетки кожи, которые находятся под сальной железой в волосяном фолликуле в области, известной как «выпуклость» 19 ; стволовые клетки кишечника, расположенные у основания крипт кишечника 20 ; сердечные стволовые клетки 21 , 22 ; стволовые клетки нервного гребня 23 , 24 ; и бронхоальвеолярные стволовые клетки в легком 25 .

ASC обеспечивают возможность коррекции дефектных тканей и органов с помощью аутологичных методов лечения, которые устраняют риск отторжения трансплантата. Подобно стратегиям, основанным на ESC, описанным выше, существует множество моделей заболевания на мышах, показывающих, что после ex vivo генетической модификации аутологичные HSCs могут восстанавливать специфический дефект в гемопоэтическом клоне. Такие исследования сыграли важную роль в разработке и совершенствовании методов лечения различных гематологических заболеваний человека, включая рак ().

Другим вариантом лечения некоторых заболеваний является введение и экспрессия рекомбинантных генов в соматических клетках (, т.е. , генная терапия) с использованием вирусных и невирусных векторов. Среди самых продолжительных и широко освещаемых исследований - исследования, направленные на детей, страдающих тяжелыми комбинированными иммунодефицитами, в которых задерживается дифференцировка Т-клеток 26 . Существует десять генетически различных типов тяжелого комбинированного иммунодефицита, каждый из которых приводит к преждевременной смерти при отсутствии терапии.Предварительные результаты генной терапии с использованием аллогенных HSC казались очень многообещающими, потому что многие люди ответили хорошо. Однако впоследствии у 3 человек из исследования, в котором участвовало около 13 человек, развился Т-клеточный лейкоз. Главный риск, связанный с опосредованным ретровирусом переносом гена, - это случайное внедрение ретровируса в протоонкогены генома. Действительно, лейкозные клетки, выделенные от пораженных людей, содержали вирусную вставку рядом с онкогеном, который, как известно, активируется хромосомной транслокацией 27 .

Одновременно с разработкой HSC для лечения иммунодефицитных расстройств появились эпидермальные стволовые клетки для лечения пациентов с тяжелыми ожогами 28 . В исследованиях, предшествовавших испытаниям на людях, мышей с ослабленным иммунитетом использовали в качестве заменителей культивированных трансплантатов эпидермальных клеток, которые производили и поддерживали здоровый участок эпидермиса человека. Хотя кожа, полученная из культивированных эпидермальных трансплантатов, не потеет и не образует волос, она спасает жизни людей с ожогами и до сих пор используется во многих странах.

После почти двух десятилетий дальнейших обширных исследований на мышах исследователи недавно разработали методы выделения и характеристики мультипотентных стволовых клеток из волосяного фолликула 29 - 31 . Одна из стратегий заключалась в выделении стволовых клеток на основе их характеристик медленного цикла и их экспрессии флуоресцентно меченного трансгена 31 . Чтобы создать универсальную модель для выделения редко циклических клеток, была сконструирована трансгенная мышь, в которой экспрессия гистона h3B, меченного зеленым флуоресцентным белком (GFP), находится под контролем регулирующего элемента, реагирующего на тетрациклин (TRE).Эта мышь может быть скрещена с любой трансгенной мышью, экспрессирующей TRE-связывающий репрессор транскрипции (отключенный тетрациклин) под контролем промотора, специфичного для любого типа клеток. Для тестирования модели промотор кератина-5 использовался для нацеливания выключенного тетрациклина на кератиноциты кожи и других многослойных эпителиальных тканей 31 . При введении доксициклина мышам с пищей экспрессия h3B-GFP была отключена, так что через 4–8 недель только редко повторяющиеся стволовые клетки сохраняли метку.Затем для выделения стволовых клеток использовали сортировку клеток, активируемую флуоресценцией.

В ситуациях, когда мало что известно об ASC ткани и, в частности, когда не были идентифицированы диагностические маркеры клеточной поверхности, модель TRE-h3B-GFP может быть полезна, если подходящий промотор для отключения тетрациклина доступный. Идентификация, очистка и мониторинг клеток с медленным циклом, сохраняющих метку, позволят исследовать степень, в которой клетки могут быть стволовыми.В экспериментах по приживлению кератиноцитов, культивируемых из одной стволовой клетки фолликула, могут образовываться участки флуоресцентного эпидермиса, сальных желез и волос на бестимусных мышах, в остальном голых 29 . Хотя еще слишком рано судить о том, будет ли технология восстановления волос на спине голой мыши превратиться в клиническое лечение заболеваний человеческого волоса, способность определять профиль транскрипции этих клеток открывает путь к выяснению механизмов путем эпителиальные стволовые клетки кожи могут реагировать на внешние сигналы, чтобы вызвать новый виток роста волос.

Успехи в переводе ASC в клинику активизировали поиск ASC в других тканях. Этот интерес был частично вызван этическими противоречиями вокруг потенциального использования ESC в терапии заболеваний человека. Однако, когда дело доходит до лечения заболевания определенного типа клеток, соответствующий ASC может быть полезен из-за его более ограниченного потенциала, при условии, что его можно культивировать in vitro, и уговорить следовать определенной линии.Хотя очень немногие ASC были успешно размножены in vitro , доступность транскрипционных профилей многих ASC определила их репертуар рецепторов клеточной поверхности, что может помочь улучшить условия культивирования в будущем.

Какие еще ASC находятся на горизонте? Мультипотентные клетки нервной ткани из головного мозга взрослой мыши были очищены и могут делиться и давать как нейроны, так и глиальные клетки в культуре 24 , 32 .Кроме того, трансплантация обогащенных нервных популяций показала клиническую полезность при лечении одноклеточных неврологических расстройств, таких как болезнь Паркинсона, которая вызывается деградацией дофаминергических нейронов в полосатом теле 33 . Однако выживаемость привитых дофаминергических нейронов, полученных из расширенного предшественника, низкая (3–5%), что указывает на необходимость повышения выживаемости клеток после трансплантации.

Поджелудочная железа показывает ограниченный клеточный оборот, и был предложен эндогенный источник стволовых клеток для регенерации инсулин-секретирующих клеток поджелудочной железы 34 .Поджелудочная железа содержит островки, секретирующие инсулин, которые регулируют уровень глюкозы у человека и разрушаются аутоиммунной атакой при диабете 1 типа. Поскольку пополнение популяций β-клеток поджелудочной железы сопровождается секрецией эндогенного инсулина, выделение стволовых клеток поджелудочной железы, которые могут продуцировать новые β-клетки, может привести к излечению от диабета 1 типа. Однако недавняя работа показывает на мышах, что уже существующие β-клетки, а не мультипотентные стволовые клетки, являются основным источником новых β-клеток во взрослой жизни и после панкреатэктомии 35 .Эта работа предполагает, что дифференцированные клетки ткани могут сохранять пролиферативную способность in vivo.

Скелетные мышцы представляют собой интересный пример для биологов, которые традиционно ищут стволовые клетки в определенной нише или резервуаре. Митотически покоящиеся миогенные предшественники называются сателлитными стволовыми клетками. Несмотря на то, что сателлитные стволовые клетки привлекли к себе большое внимание при лечении людей, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна, функциональные свойства этих мышечных стволовых клеток остаются неясными.Клональная популяция мышечных клеток-предшественников была идентифицирована и после внутримышечной или внутривенной инъекции приводит к регенерации мышц и частичному восстановлению дистрофина у мышей mdx , модели мышечной дистрофии Дюшенна 36 . После внутриартериальной инъекции изолированные мышечные предшественники, по-видимому, приживают дистрофические мышцы мышей и участвуют в регенерации после повреждения мышц 37 , 38 . Остается неясным, представляют ли какие-либо из этих культивируемых клеток чистый пул стволовых клеток; тем не менее, линии миогенных клеток могут быть полезны в качестве источника миогенных предшественников для прямой или системной трансплантации.

Анализ свойств предполагаемых генов стволовых клеток

С появлением технологии массивов генов молекулярная характеристика стволовых клеток сделала шаг вперед, предоставив исчерпывающие снимки транскрипционных профилей этих клеток. Этот прогресс побудил исследователей обратиться к некоторым фундаментальным вопросам биологии стволовых клеток. Являются ли определенные особенности общими для всех стволовых клеток? Чем ASC отличаются от ESC? Какие молекулярные механизмы контролируют состояние покоя стволовых клеток и их способность к самообновлению? И как стволовые клетки активируются при их превращении из неподвижной мультипотентной клетки в коммитированную клетку, которая временно делится и дифференцируется по определенному клону?

Две основные проблемы стоят перед исследователями, пытающимися использовать транскрипционный репертуар мультипотентных стволовых клеток.Первый - это разработка стратегий выделения и очистки этих второстепенных компонентов ткани; второй - выбор того, с чем сравнивать эти ячейки. В ранних исследованиях такого рода Иванова и соавт. 39 использовали маркеры клеточной поверхности и клеточную сортировку, активируемую флуоресценцией, для выделения и определения профиля транскрипции HSC и их ранних коммитированных транзиентных потомков амплификации. Рамальо-Сантос и др. 40 использовали аналогичные методы для выделения HSC, но сравнили их профили транскрипции с профилями цельного костного мозга.Несмотря на воспроизводимые данные массива для HSC, список того, что составляет «стволовость» HSC, заметно отличался в двух исследованиях. Одна группа определила гены, которые были активированы в HSC по сравнению со всей гетерогенной тканью, окружающей клетки, тогда как другая определила гены, экспрессия которых изменилась, поскольку HSCs изменили свои свойства и вступили в клон. Оба типа сравнения полезны, но они дают очень разную информацию.

Поскольку все больше стволовых клеток и их потомков выделяются и профилируются, подробные данные об экспрессии накапливаются с большой скоростью.Ученые начали пожинать плоды этих молекулярных сигнатур, более глубоко исследуя механизмы, с помощью которых стволовые клетки поддерживаются в их нишах в состоянии покоя и дифференцировки, и как они становятся мобилизованными, когда они покидают свои ниши и выбирают определенную линию.

Многие примеры показывают, как молекулярные маркеры, иногда в сочетании с моделями трансгенных и нокаутных мышей, дают представление о механизмах, лежащих в основе поддержания и самообновления стволовых клеток.Hoxb4, например, представляет собой фактор транскрипции, содержащий гомеодомен, который обнаружен в нескольких различных массивах. Hoxb4 увеличивает жизнеспособность и пролиферацию при сверхэкспрессии в мышиных HSC 41 , что, в свою очередь, дает повышенную эффективность спасения при трансплантации мышам с истощенными HSC. Другим примером является Bmi-1, член регулирующего хроматин комплекса Polycomb, который необходим для генерации самообновляющихся взрослых HSCs 42 и для самообновления нервных стволовых клеток 43 .

Не менее важны, чем факторы ремоделирования хроматина, в управлении стволовыми клетками пути передачи сигнала. Передача сигналов Wnt стала универсальным регулятором стволовых клеток, но то, как именно Wnts действуют на стволовые клетки, остается предметом интенсивных дискуссий 44 . Клетки отвечают на каноническую передачу сигналов Wnt, стабилизируя избыток β-катенина, который не используется в клеточной адгезии. Этот стабилизированный β-катенин затем может свободно связываться и действовать как транскрипционный кофактор для членов семейства ДНК-связывающих белков Lef1 или Tcf.Трансгенная сверхэкспрессия конститутивно стабилизированной версии β-catenin в эпидермисе кожи приводит к морфогенезу de novo волосяных фолликулов, что характерно для мультипотентных эмбриональных стволовых клеток кожи, но не для эпидермиса взрослых 45 . Немного более низкие уровни передачи сигналов Wnt приводят к активации ASC существующих волосяных фолликулов 46 . Напротив, мутации с потерей функции в β-catenin полностью блокируют образование волосяных фолликулов 47 . В кишечнике потеря партнера β-катенина Tcf4 блокирует образование ткани 48 .

В нервной системе трансгенная сверхэкспрессия β-катенина приводит к увеличению мозга и увеличению популяции предшественников 49 , тогда как в стволовых клетках нервного гребня стабилизированный β-катенин мало влияет на размер популяции и вместо этого регулирует решения судьбы 50 . В предшественниках костного мозга инактивация β-catenin in vivo , по-видимому, не нарушает способность этих клеток к самообновлению и воссозданию гематопоэтических клонов 51 .Но сверхэкспрессия β-катенина в культивируемых потомках изолированных HSC способствует пролиферации этих клеток, которые при введении в кровь смертельно облученных мышей, по крайней мере, поддерживают продукцию миелоидных, B- и T-клеточных линий 52 .

В то время как исследователи изучают механизмы, лежащие в основе передачи сигналов Wnt в биологии стволовых клеток, они также изучают, как другие пути могут действовать согласованно, чтобы интегрировать биологию стволовых клеток. Подобно передаче сигналов Wnt, передача сигналов Notch и костных морфогенетических белков, по-видимому, оказывает плейотропные эффекты на стволовые клетки и их клоны, и эти эффекты, по-видимому, различаются для разных стволовых клеток 53 .Остается неясным, действуют ли эти факторы на уровне самообновления стволовых клеток, активации стволовых клеток или кратковременной амплифицирующей пролиферации или дифференцировки клеток. Напр., Нарушение ткани, наблюдаемое в моделях нокаута мышей, может возникать либо из-за дефекта стволовых клеток, либо из-за неспособности пролиферировать потомство временных амплифицирующих клеток. Точно так же влияние сигнального фактора на пролиферацию культивируемых стволовых клеток может быть либо признаком повышенной пролиферации потомства временных амплифицирующих клеток в культуре, либо признаком самообновления стволовых клеток.По мере проведения будущих исследований должно стать очевидным, поддерживаются и размножаются ли стволовые клетки с помощью общего набора регуляторных путей и молекулярных принципов, или кажущееся противоположное влияние сигнальных молекул на поведение различных клеток является отражением разнообразия. ИСК.

Стволовые клетки дома

В тканях взрослых мультипотентные стволовые клетки часто спрятаны в защищенных местах или нишах. Самая защищенная ниша - это костный мозг, в котором находятся ГСК.Кожу можно микродиссектировать на единицы, в которых каждый волосяной фолликул имеет крошечную нишу (выпуклость) стволовых клеток, которые отвечают за образование новых волос во время цикла роста волос и за пополнение клеток сальной железы и эпидермиса при травмах. 54 . Точно так же кишечник состоит из сотен единиц, каждая из которых содержит ворсинки и крипту, а стволовые клетки расположены кольцом прямо над основанием крипты. Стволовые клетки в каждой крипте ответственны за создание четырех линий абсорбционных и секреторных клеток, которые составляют крипту и ворсинку 20 .В центральной нервной системе взрослого человека стволовые клетки расположены в субвентрикулярной зоне, где они могут генерировать глию и нейроны 24 .

Важность ниши лучше всего иллюстрируется экспериментами, в которых судьба ESCs отслеживается после их подкожной инъекции иммунодефицитным голым мышам. При помещении в инородную среду окружающей in vivo ткани, ESC образуют доброкачественные тератомы, которые содержат множество типов клеток 55 .Это исследование показывает важность соответствующей микросреды для конкретных межклеточных взаимодействий и клеточной организации.

Большинство стволовых клеток совершают дифференцировку по определенным линиям, когда они покидают свою нишу. ГСК кажутся исключением, потому что они могут циркулировать в кровотоке и возвращаться домой относительно невредимыми в процессе, называемом наведением 56 . Эксперименты с использованием генетически маркированных мышей с парабиотиками CD45.1 и CD45.2, которые имеют общую циркуляцию, были проведены для изучения миграции HSC из костного мозга через кровь 57 .Результаты показывают, что HSC, обнаруживаемые в периферической крови, мигрировали из своей ниши, что приводит к возможности того, что HSC, передаваемые через кровь, могут быть источником плюрипотентных или мультипотентных стволовых клеток, доступных для восстановления как негематопоэтических, так и гематопоэтических тканей 57 .

Поскольку стволовые клетки зависят от окружающей среды для поддержания своих свойств стволовых клеток, развитие ниши имеет решающее значение 14 . Внутри ниши стволовые клетки обычно поддерживают среду, препятствующую росту и дифференцировке.Каждый раз, когда стволовой клетке предлагается покинуть нишу, ее необходимо пополнять, предположительно путем самообновления. И наоборот, чтобы стволовая клетка покинула нишу и последовала определенному клону, ее микросреда должна измениться, накапливать или утратить важные факторы, которые в противном случае удерживают ее в ее нише.

Генетические исследования половых клеток Drosophila melanogaster дают лучшее представление о том, как это изменение могло произойти. 58 . Хотя исследования ниш млекопитающих отстают, недавняя характеристика и генетические манипуляции с мышиными ASC и их нишами привели к прогрессу в нашем понимании того, что составляет эту среду в биологии стволовых клеток млекопитающих.Такие исследования также дали представление о том, как ключевые сигнальные пути регулируют поведение стволовых клеток.

Среди наиболее интересных достижений в этой области - исследования глубины ниши костного мозга HSC, выстланной пространственно ориентированными остеобластами. По мере того, как HSC прогрессивно созревают, они теряют контакт с этими соседними стромальными клетками, становятся более пролиферативными, направляются в центральную полость костного мозга и проникают в кровеносные сосуды. Когда мышей генетически изменяют для увеличения популяции остеобластов на внутренней поверхности кости, количество HSC одновременно увеличивается, и способность этих новых HSC сохранять свои свойства медленного цикла, по-видимому, зависит от их способности напрямую прикрепляться к остеобластам через N-кадгерин. –Опосредованные спаечные соединения 59 .Эти исследования выявили решающую роль остеобластов в поддержании долгоживущих и наиболее ценных HSC. Данные также показывают, что по крайней мере некоторые HSC контактируют с синусоидальным эндотелием кровеносных сосудов в костном мозге, что может объяснить, почему HSC могут быть мобилизованы в кровоток с очень быстрой кинетикой 60 . Примечательно, что недавно было показано, что эмбриональные стволовые клетки кожи используют адгезивные соединения для контроля асимметричного деления клеток, что может иметь широкое значение для стволовых клеток 61 .

В заключение следует отметить, что характеристика стволовых клеток мышей и манипуляции с ними привели к широкому спектру клинических применений и многообещающим направлениям для будущих исследований. Внедряя эту мощную технологию из области моделей мышей в клинические условия, ученым всего мира необходимо будет разработать руководящие принципы, которые сбалансируют моральные и этические соображения с пользой для терапевтической медицины. При этом ответственность за эффективное общение и убеждение общественности в важности продвижения вперед лежит на ученых.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарим M. Schober, V. Horsley и C. Blanpain за обсуждения и советы во время подготовки этого обзора. Г.Г. является получателем программы Human Frontier Science Programme. E.F. - исследователь Медицинского института Говарда Хьюза и получатель финансирования от Национальных институтов здравоохранения США.

Ссылки

1. Evans MJ, Kaufman MH. Создание в культуре плюрипотенциальных клеток из эмбрионов мыши. Природа. 1981; 292: 154–156. [PubMed] [Google Scholar] 2.Мартин ГР. Выделение линии плюрипотентных клеток из ранних эмбрионов мыши, культивированных в среде, кондиционированной стволовыми клетками тератокарциномы. Proc. Natl. Акад. Sci. США. 1981; 78: 7634–7638. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 3. Брэдли А., Эванс М., Кауфман М. Х., Робертсон Э. Формирование химер зародышевой линии из клеточных линий тератокарциномы, полученных из эмбрионов. Природа. 1984. 309: 255–256. [PubMed] [Google Scholar] 4. Клуг MG, Soonpaa MH, Koh GY, Field LJ. Генетически отобранные кардиомиоциты из дифференцирующихся эмбриональных стволовых клеток образуют стабильные внутрисердечные трансплантаты.J. Clin. Вкладывать деньги. 1996. 98: 216–224. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 5. Ким Дж. Х. и др. Дофаминовые нейроны, полученные из эмбриональных стволовых клеток, функционируют в животной модели болезни Паркинсона. Природа. 2002; 418: 50–56. [PubMed] [Google Scholar] 6. Brustle O и др. Глиальные предшественники, полученные из эмбриональных стволовых клеток: источник миелинизирующих трансплантатов. Наука. 1999. 285: 754–756. [PubMed] [Google Scholar] 7. Chinzei R, et al. Клетки эмбриональных тельцов, полученные из линии эмбриональных стволовых клеток мыши, дифференцируются в функциональные гепатоциты.Гепатология. 2002; 36: 22–29. [PubMed] [Google Scholar] 8. Hochedlinger K, Jaenisch R. Моноклональные мыши, полученные путем переноса ядра из зрелых B- и T-донорных клеток. Природа. 2002; 415: 1035–1038. [PubMed] [Google Scholar] 9. Вакаяма Т. и др. Дифференциация линий эмбриональных стволовых клеток, полученных из взрослых соматических клеток путем переноса ядра. Наука. 2001; 292: 740–743. [PubMed] [Google Scholar] 10. Rideout WM, III, Hochedlinger K, Kyba M, Daley GQ, Jaenisch R. Исправление генетического дефекта с помощью ядерной трансплантации и комбинированной клеточной и генной терапии.Клетка. 2002; 109: 17–27. [PubMed] [Google Scholar] 11. Барбери Т. и др. Спецификация нейронного подтипа эмбриональных стволовых клеток при оплодотворении и переносе ядра и применение у мышей с паркинсонизмом. Nat. Biotechnol. 2003. 21: 1200–1207. [PubMed] [Google Scholar] 12. Hwang WS и др. Эмбриональные стволовые клетки, специфичные для пациента, полученные из бластоцист SCNT человека. Наука. 2005; 308: 1777–1783. [PubMed] [Google Scholar] 13. Cowan CA, Atienza J, Melton DA, Eggan K. Ядерное перепрограммирование соматических клеток после слияния с человеческими эмбриональными стволовыми клетками.Наука. 2005; 309: 1369–1373. [PubMed] [Google Scholar] 14. Фукс Э., Тумбар Т., Гуаш Г. Общение с соседями: стволовые клетки и их ниша. Клетка. 2004. 116: 769–778. [PubMed] [Google Scholar] 15. Spangrude GJ, Heimfeld S, Weissman IL. Очистка и характеристика гемопоэтических стволовых клеток мыши. Наука. 1988. 241: 58–62. [PubMed] [Google Scholar] 16. Ford CE, Hamerton JL, Barnes DW, Loutit JF. Цитологическая идентификация радиационных химер. Природа. 1956; 177: 452–454. [PubMed] [Google Scholar] 17.Бакнер CD и др. Аллогенное приживление костного мозга после облучения всего тела у пациента с лейкемией. Кровь. 1970; 35: 741–750. [PubMed] [Google Scholar] 18. Сил П., Асакура А., Рудницкий М.А. Потенциал мышечных стволовых клеток. Dev. Клетка. 2001; 1: 333–342. [PubMed] [Google Scholar] 19. Cotsarelis G, Sun TT, Lavker RM. Клетки, сохраняющие метку, находятся в области выпуклости волосистой части тела: это влияет на фолликулярные стволовые клетки, цикл роста волос и канцерогенез кожи. Клетка. 1990; 61: 1329–1337. [PubMed] [Google Scholar] 20.Loeffler M, Birke A, Winton D, Potten C. Соматические мутации, моноклональность и стохастические модели организации стволовых клеток в кишечном крипте. J. Theor. Биол. 1993; 160: 471–491. [PubMed] [Google Scholar] 21. Бельтрами А.П. и др. Взрослые кардиальные стволовые клетки мультипотентны и поддерживают регенерацию миокарда. Клетка. 2003. 114: 763–776. [PubMed] [Google Scholar] 23. Buchstaller J, et al. Эффективное выделение и профилирование экспрессии генов небольшого количества стволовых клеток нервного гребня и развивающихся шванновских клеток.J. Neurosci. 2004. 24: 2357–2365. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 24. Doetsch F, Caille I, Lim DA, Garcia-Verdugo JM, Alvarez-Buylla A. Астроциты субвентрикулярной зоны представляют собой нервные стволовые клетки в мозге взрослых млекопитающих. Клетка. 1999; 97: 703–716. [PubMed] [Google Scholar] 25. Kim CF, et al. Идентификация бронхоальвеолярных стволовых клеток при нормальном раке легких и легких. Клетка. 2005; 121: 823–835. [PubMed] [Google Scholar] 26. Cavazzana-Calvo M, et al. Генная терапия тяжелого комбинированного иммунодефицита человека (SCID) -X1 болезни.Наука. 2000. 288: 669–672. [PubMed] [Google Scholar] 27. Hacein-Bey-Abina S, et al. LMO2-ассоциированная пролиферация клональных Т-клеток у двух пациентов после генной терапии SCID-X1. Наука. 2003. 302: 415–419. [PubMed] [Google Scholar] 28. Gallico GG, III, O'Connor NE, Compton CC, Kehinde O, Green H. Постоянное покрытие больших ожоговых ран аутологичным культивированным эпителием человека. N. Engl. J. Med. 1984; 311: 448–451. [PubMed] [Google Scholar] 29. Blanpain C, Lowry WE, Geoghegan A, Polak L, Fuchs E. Самообновление, мультипотентность и существование двух популяций клеток в нише эпителиальных стволовых клеток.Клетка. 2004. 118: 635–648. [PubMed] [Google Scholar] 30. Моррис Р.Дж. и др. Захват и профилирование стволовых клеток взрослых волосяных фолликулов. Nat. Biotechnol. 2004; 22: 411–417. [PubMed] [Google Scholar] 32. Rietze RL, et al. Очистка плюрипотентных нервных стволовых клеток из мозга взрослой мыши. Природа. 2001; 412: 736–739. [PubMed] [Google Scholar] 33. Studer L, Tabar V, McKay RD. Трансплантация расширенных предшественников мезэнцефалита приводит к выздоровлению крыс с паркинсонизмом. Nat. Neurosci. 1998; 1: 290–295. [PubMed] [Google Scholar] 34.Сиберг Р.М. и др. Клональная идентификация мультипотентных предшественников из поджелудочной железы взрослых мышей, которые генерируют нервные и панкреатические клоны. Nat. Biotechnol. 2004. 22: 1115–1124. [PubMed] [Google Scholar] 35. Дор Й, Браун Дж, Мартинес О.И., Мелтон Д.А. Взрослые β-клетки поджелудочной железы образуются путем самодублирования, а не дифференцировки стволовых клеток. Природа. 2004; 429: 41–46. [PubMed] [Google Scholar] 36. Ли JY и др. Клональная изоляция мышечных клеток, способных улучшить регенерацию мышц и заживление костей.J. Cell Biol. 2000; 150: 1085–1100. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 37. Torrente Y, et al. Внутриартериальная инъекция мышечных стволовых клеток CD34 + Sca-1 + восстанавливает дистрофин у мышей mdx . J. Cell Biol. 2001. 152: 335–348. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 38. Collins CA, et al. Функция стволовых клеток, самообновление и поведенческая неоднородность клеток из ниши взрослых мышечных сателлитных клеток. Клетка. 2005; 122: 289–301. [PubMed] [Google Scholar] 39.Иванова Н.Б., и др. Молекулярная сигнатура стволовых клеток. Наука. 2002; 298: 601–604. [PubMed] [Google Scholar] 40. Рамальо-Сантос М., Юн С., Мацузаки Ю., Маллиган Р.С., Мелтон Д.А. «Стебель»: профили транскрипции эмбриональных и взрослых стволовых клеток. Наука. 2002; 298: 597–600. [PubMed] [Google Scholar] 41. Антончук Дж., Соважо Дж., Хамфрис РК. HOXB4-индуцированная экспансия взрослых гемопоэтических стволовых клеток ex vivo . Клетка. 2002; 109: 39–45. [PubMed] [Google Scholar] 42. Парк И.К. и др. Bmi-1 необходим для поддержания самообновляющихся гемопоэтических стволовых клеток взрослых.Природа. 2003; 423: 302–305. [PubMed] [Google Scholar] 43. Молофский А.В., и др. Зависимость от Bmi-1 отличает самообновление нервных стволовых клеток от пролиферации предшественников. Природа. 2003; 425: 962–967. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 44. Клебер М., Соммер Л. Передача сигналов Wnt и регуляция функции стволовых клеток. Curr. Opin. Cell Biol. 2004. 16: 681–687. [PubMed] [Google Scholar] 45. Gat U, DasGupta R, Degenstein L, Fuchs E. De novo Морфогенез волосяного фолликула и опухоли волос у мышей, экспрессирующих усеченный β-катенин в коже.Клетка. 1998. 95: 605–614. [PubMed] [Google Scholar] 47. Huelsken J, Vogel R, Erdmann B, Cotsarelis G, Birchmeier W. β-Катенин контролирует морфогенез волосяного фолликула и дифференцировку стволовых клеток в коже. Клетка. 2001; 105: 533–545. [PubMed] [Google Scholar] 48. Коринек В. и др. Истощение компартментов эпителиальных стволовых клеток в тонком кишечнике мышей, лишенных Tcf-4. Nat. Genet. 1998. 19: 379–383. [PubMed] [Google Scholar] 49. Ченн А., Уолш, Калифорния. Регулирование размера коры головного мозга путем контроля выхода из клеточного цикла в нервных предшественниках.Наука. 2002. 297: 365–369. [PubMed] [Google Scholar] 50. Ли Х.Й. и др. Инструктивная роль Wnt / β-catenin в спецификации сенсорной судьбы в стволовых клетках нервного гребня. Наука. 2004. 303: 1020–1023. [PubMed] [Google Scholar] 52. Рейя Т. и др. Роль передачи сигналов Wnt в самообновлении гемопоэтических стволовых клеток. Природа. 2003; 423: 409–414. [PubMed] [Google Scholar] 53. Дункан А.В. и др. Интеграция передачи сигналов Notch и Wnt в поддержание гемопоэтических стволовых клеток. Nat. Иммунол. 2005. 6: 314–322. [PubMed] [Google Scholar] 54.Осима Х., Рочат А., Кедзия С., Кобаяши К., Баррандон Ю. Морфогенез и обновление волосяных фолликулов из взрослых мультипотентных стволовых клеток. Клетка. 2001; 104: 233–245. [PubMed] [Google Scholar] 55. Томсон Дж. А. и др. Линии эмбриональных стволовых клеток, полученные из бластоцист человека. Наука. 1998. 282: 1145–1147. [PubMed] [Google Scholar] 56. Quesenberry PJ, Colvin G, Abedi M. Перспектива: фундаментальные и клинические концепции самонаведения и приживления стволовых клеток: путешествие в ниши и за их пределы. Exp. Гематол. 2005; 33: 9–19.[PubMed] [Google Scholar] 57. Райт Д.Е., Уэйджерс А.Дж., Гулати А.П., Джонсон, Флорида, Вайсман, Иллинойс. Физиологическая миграция гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников. Наука. 2001; 294: 1933–1936. [PubMed] [Google Scholar] 58. Ямасита Ю.М., Фуллер М.Т., Джонс Д.Л. Передача сигналов в нишах стволовых клеток: уроки зародышевой линии Drosophila . J. Cell Sci. 2005. 118: 665–672. [PubMed] [Google Scholar] 59. Чжан Дж. И др. Идентификация ниши гемопоэтических стволовых клеток и контроль размера ниши. Природа. 2003; 425: 836–841.[PubMed] [Google Scholar] 60. Киль MJ и др. Рецепторы семейства SLAM различают гемопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники и выявляют эндотелиальные ниши для стволовых клеток. Клетка. 2005; 121: 1109–1121. [PubMed] [Google Scholar] 61. Lechler T, Fuchs E. Асимметричные деления клеток способствуют расслоению и дифференцировке кожи млекопитающих. Природа. 2005; 437: 275–280. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 62. Гудман Дж. В., Ходжсон Г. С.. Доказательства наличия стволовых клеток в периферической крови мышей. Кровь. 1962; 19: 702–714.[PubMed] [Google Scholar] 63. Flanagan SP. «Nude», новый ген безволосости с плейотропными эффектами у мышей. Genet. Res. 1966; 8: 295–309. [PubMed] [Google Scholar] 64. Харрисон DE. Конкурентная репопуляция: новый анализ долгосрочной функциональной способности стволовых клеток. Кровь. 1980; 55: 77–81. [PubMed] [Google Scholar] 65. Томас KR, Капеччи MR. Сайт-направленный мутагенез путем нацеливания на ген в стволовых клетках, полученных из эмбрионов мыши. Клетка. 1987. 51: 503–512. [PubMed] [Google Scholar] 66. МакКьюн Дж. М. и др. Мышь SCID-hu: мышиная модель для анализа дифференцировки и функции гематолимфоидов человека.Наука. 1988; 241: 1632–1639. [PubMed] [Google Scholar] 67. Томпсон С., Кларк А. Р., Пау А. М., Хупер М. Л., Мелтон Д. В.. Передача по зародышевой линии и экспрессия скорректированного гена HPRT, продуцируемого нацеливанием гена в эмбриональных стволовых клетках. Клетка. 1989; 56: 313–321. [PubMed] [Google Scholar] 68. Любин И. и др. Приживление и развитие человеческих Т- и В-клеток у мышей после трансплантации костного мозга. Наука. 1991; 252: 427–431. [PubMed] [Google Scholar] 69. Shinkai Y, et al. У мышей с дефицитом RAG-2 отсутствуют зрелые лимфоциты из-за неспособности инициировать перестройку V (D) J.Клетка. 1992. 68: 855–867. [PubMed] [Google Scholar] 70. Кэмпбелл К.Х., МакВир Дж., Ричи В.А., Уилмут И. Овцы, клонированные путем переноса ядра из культивируемой клеточной линии. Природа. 1996. 380: 64–66. [PubMed] [Google Scholar] 71. Томсон Дж. А. и др. Линии эмбриональных стволовых клеток, полученные из бластоцист человека. Наука. 1998. 282: 1145–1147. [PubMed] [Google Scholar] 72. Munsie MJ, et al. Выделение плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток из перепрограммированных ядер соматических клеток взрослых мышей. Curr. Биол. 2000; 10: 989–992. [PubMed] [Google Scholar] 73.Динсмор Дж. И др. Эмбриональные стволовые клетки дифференцировали in vitro и как новый источник клеток для трансплантации. Трансплантация клеток. 1996. 5: 131–143. [PubMed] [Google Scholar] 74. Ямамото Х. и др. Дифференциация эмбриональных стволовых клеток в гепатоциты: биологические функции и терапевтическое применение. Гепатология. 2003; 37: 983–993. [PubMed] [Google Scholar] 75. Мин JY и др. Трансплантация эмбриональных стволовых клеток улучшает сердечную функцию у постинфарктных крыс. J. Appl. Physiol. 2002. 92: 288–296.[PubMed] [Google Scholar]

Содержание и уход за домашними крысами

Крысы стали домашними животными только за последние 100 лет, но они умны, дружелюбны и любят обниматься, что делает их отличными компаньонами для семей и детей. Это игривые животные, жаждущие человеческого общения. Уход за домашней крысой несколько сложен; вам понадобятся подходящие аксессуары, игрушки и клетка для вашего питомца. Несмотря на то, что они от природы недолговечны, у них могут развиться различные проблемы со здоровьем.

Обзор видов

Общее название: Крыса

Научное название: Rattus rattus

Взрослый размер: Тело достигает от 9 до 11 дюймов, с дополнительными 8 дюймами хвоста в среднем. 3 года

Поведение и темперамент крысы

Крысы, в отличие от некоторых других грызунов, умные и игривые животные, жаждущие человеческого общения.Они также (вопреки мифу) очень чистые и почти не имеют запаха. Они любят играть и даже учатся трюкам.

8 вещей, которые нужно знать, прежде чем завести домашнюю крысу

Крыса в доме

Лучше всего использовать большую проволочную клетку, особенно с горизонтальными перекладинами, которые позволяют крысе лазить по бокам. Высокая клетка с пандусами и платформами идеально подходит для размещения нескольких крыс. Как минимум, клетка с площадью пола 12 на 24 дюйма (2 квадратных фута) подойдет для двух крыс поменьше, если клетка высокая и вы предоставите полки и / или гамаки для дополнительного жилого пространства.Однако клетки большего размера всегда лучше. Больших аквариумов недостаточно, поскольку они не обеспечивают хорошей вентиляции.

Избегайте клеток с проволочным настилом; Проведение времени на проволочном настиле связано с небольшими порезами, которые могут привести к появлению шмелей у крыс. При необходимости вы можете модифицировать балконы из проволоки, накрыв их тонким листом дерева, меламина или другим легко очищаемым твердым материалом (прикрепленным к клетке с помощью проволочных стяжек).

В идеале клетку следует разместить в относительно тихом месте, но все же рядом с местом, где в доме ведется общественная жизнь.Избегайте попадания прямых солнечных лучей или сквозняков. Крысы ведут ночной образ жизни, поэтому в течение дня держите свое пространство достаточно тихим. Ограничьте доступ к клетке другим домашним животным; крыса почувствует угрозу со стороны парящей кошки или собаки. Размещение клетки на столе или подставке поможет домашним крысам чувствовать себя в большей безопасности.

Обеспечьте гнездовой материал, например бумагу без чернил, салфетки или бумажные полотенца, которые крысы могут использовать в качестве подстилки. Избегайте токсичных стружек кедра и сосны, но подойдут и стружки из осины или других твердых пород.Есть много хороших подстилок и подстилок для домашних животных, которые хорошо впитывают влагу, не пылятся и безопасны для мелких домашних животных; рассмотрите возможность использования гранулированных продуктов (обычно очень абсорбирующих) под слоем более мягкой рыхлой подстилки. Обычно крысы выбирают специально отведенное место для ванной в одной части клетки. Ежедневно вычерпывайте сильно загрязненный подстилку и при необходимости добавляйте подстилку. Очистите всю клетку и раз в неделю меняйте подстилку и подстилку.

Обеспечьте своей домашней крысе гнездовой ящик. Картонную коробку придется часто менять.Другие возможности включают в себя горшок или банку, перевернутую на бок. Коробки, купленные в магазине, тоже подойдут, но деревянные бывает трудно чистить, когда они окрашиваются мочой, а пластиковые коробки довольно быстро пережевываются.

Лианн Маклеод

Еда и вода

Для воды можно использовать бутыль с трубкой-сиппером. Следите за тем, чтобы всегда была под рукой свежая чистая вода. Тяжелая керамическая посуда для еды лучше всего подходит для крыс, поскольку она прочная, не опрокидывается и ее легко мыть.

Для крыс доступны гранулированные или блочные диеты, составленные таким образом, чтобы они были полноценными по питательности. Выберите крысиный блок с низким содержанием жиров и калорий и соевый шрот в списке ингредиентов, а не кукурузу. В то время как крысиные блоки должны составлять основную диету, в качестве дополнения можно использовать различные свежие продукты, которые помогут сохранить здоровье крыс и предотвратить скуку гранулированной диетой. Также доступны расфасованные сыпучие смеси, но крысы, как правило, выбирают из смеси свои любимые кусочки и не придерживаются сбалансированной диеты; поменять местами все предложенные варианты питания.

Попробуйте кормить своих домашних крыс небольшим количеством фруктов и овощей, цельнозерновой пастой и хлебом, коричневым рисом, йогуртом и иногда нежирным жареным мясом, мучными червями, сыром, семенами и орехами. Кроме того, домашним крысам можно давать такие угощения, как собачье печенье. Важно, чтобы крысы придерживались диеты с высоким содержанием клетчатки и низким содержанием жиров, поэтому ограничьте потребление продуктов с высоким содержанием жира, таких как сыр, семена и орехи. Крысы немного сладкоежка, но сопротивляются искушению кормить сладкой или нездоровой пищей, включая шоколад.

Общие проблемы со здоровьем

У крыс могут развиться многие из тех же проблем, что и у кошек, собак и даже людей. Возможные проблемы варьируются от опухолей до респираторных или пищеварительных заболеваний и неврологических проблем. Хотя физически возможно провести операцию на крысе, немногие владельцы готовы за это платить, поэтому профилактика заболеваний - лучший вариант. Если возможно, найдите ветеринара-экзотика в вашем районе (ветеринара с опытом лечения необычных домашних животных) и назначьте первоначальный прием для сбора исходных данных о состоянии здоровья.Осмотр каждые шесть месяцев - лучший шаг к профилактике или лечению заболевания.

Шмель (язвенный пододерматит , ) - болезненное состояние у крыс, которое вызывает язвы на подошвах ног животных. Если его не лечить, это может привести к летальному исходу. Это состояние обычно развивается, когда небольшая рана на стопе заражается Staphylococcus aureus или E. coli.

Покупка крысы

Крысы, как и кошки, бывают самых разных цветов и цветовых комбинаций, включая белый с розовыми глазами (альбинос), коричный, сине-серый и разноцветный.У всех крыс, кроме альбиносов, темные глаза. Вы также можете выбрать «навороченную» крысу; они доступны только у заводчиков. Причудливые разновидности включают кудрявых рексов, бесхвостых и голых крыс, а также атласных крыс с блестящей шерстью. У крыс дамбо большие уши, а у крыс с шерстью щетины - жесткая шерсть.

Если вы не ищете причудливую крысу, вы можете легко усыновить детенышей в спасательном центре или купить одного (в идеале - двух) в местном зоомагазине. Внимательно посмотрите на своих потенциальных питомцев, чтобы убедиться, что они активны и здоровы с чистой, ухоженной шерстью.Выделите время и понаблюдайте за тем, как крыса ест и пьет правильно. Наконец, убедитесь, что другие крысы, с которыми он живет, также здоровы, активны и чисты.

Время игры для вашей крысы

Крысы любят карабкаться по лестницам, веревкам, гамакам, туннелям и платформам. Обеспечьте предметы обогащения, такие как деревянные блоки для жевания, картонные трубки и игрушки, предназначенные для хорьков или попугаев. Ищите веревочные и деревянные игрушки, так как большинство пластиковых игрушек не выдерживают грызения решительной крысы.Из простых предметов, таких как большие картонные почтовые тубы, мятая бумага, бумажные пакеты и картонные коробки, также можно сделать замечательные самодельные игрушки для крыс.

Крысы очень умны, и их нужно бросать вызов, поэтому регулярно меняйте игрушки, чтобы не скучать. Некоторым крысам нравится бегать на колесах для упражнений (а некоторые никогда не попытаются!), Но проволока, обычно встречающаяся в зоомагазинах, не очень безопасна для крыс, которые могут зацепиться за ступни, пальцы ног или хвост; колесо с твердым покрытием предпочтительнее.

Игровая площадка за пределами клетки должна быть защищена от крыс, поскольку крысы будут грызть все, что попадется зубами.Самое главное, убедитесь, что электрические провода находятся вне досягаемости или заключены в жесткие пластиковые трубки. Убедитесь, что ваша крыса не может получить доступ ко всему токсичному, включая ядовитые растения. Крысы также имеют тенденцию ощущать запахи, когда бродят, оставляя маленькие капли мочи. Запах не имеет неприятного запаха, но вы можете накрыть мебель пледом, когда она находится вне клетки. Они также оставят след на своих владельцах, так что будьте готовы!

Обрезка ногтей

У крыс острые ногти на ногах; обрезать их каждые 1-2 месяца.Обрезать ногти несложно, однако крыса, вероятно, возразит и попытается ускользнуть. При необходимости используйте кусачки для человеческих ногтей, чтобы немного обрезать кончик. Избегайте розовой части (быстрой), которая может быть видна внутри ногтя; здесь кровеносные сосуды и нервы.

Если вы случайно порезали кровеносный сосуд, нанесите немного кукурузного крахмала на кончик ногтя, чтобы остановить кровотечение. (Вы также можете купить в зоомагазине Kwik Stop продукт, который используется таким же образом.) В то же время, когда вы проверяете ногти, постарайтесь взглянуть на зубы, чтобы убедиться, что они не заросли. Предоставьте крысам множество возможностей (с помощью деревянных блоков и игрушек) жевать; это сделает их зубы короткими и здоровыми.

Вид, похожий на крысу

Если вас интересуют домашние крысы, обратите внимание на:

В противном случае обратите внимание на других мелких животных, которые могут быть вашим домашним животным!

Создание эмбриональных стволовых клеток крыс и получение крыс-химер

Abstract

Крыса является эталонной животной моделью для физиологических исследований и для анализа мультигенных заболеваний человека, таких как гипертония, диабет, неврологические расстройства и рак.Крысы уже давно используются в обширных исследованиях химического канцерогенеза. Таким образом, эмбриональные стволовые клетки крысы (rES) являются важным ресурсом для изучения моделей заболеваний. Попытки получить ES-клетки от различных млекопитающих, включая крысу, не увенчались успехом. Здесь мы установили две независимые rES-клетки из бластоцист крысы Wister, которые имеют недифференцированные признаки, такие как экспрессия генов Nanog и Oct3 / 4, и они имеют стадийно-специфический эмбриональный антиген (SSEA) -1, -3, -4 и TRA-1-. 81 выражение.Клетки были успешно культивированы в недифференцированном состоянии, и возможно более 18 пассажей с сохранением более 40% нормального кариотипа. Их плюрипотентный потенциал был подтвержден дифференцировкой на производные энтодермы, мезодермы и эктодермы. Что наиболее важно, клетки rES способны продуцировать химерных крыс. Таким образом, мы создали плюрипотентные линии клеток rES, которые широко используются для получения генетически модифицированных экспериментальных крыс для изучения болезней человека.

Образец цитирования: Ueda S, Kawamata M, Teratani T, Shimizu T., Tamai Y, Ogawa H, et al. (2008) Создание эмбриональных стволовых клеток крыс и создание химерных крыс. PLoS ONE 3 (7): e2800. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0002800

Редактор: Maarten M. S. van Lohuizen, Нидерландский институт рака, Нидерланды

Поступила: 15 февраля 2008 г .; Принято к печати: 1 июля 2008 г .; Опубликовано: 30 июля 2008 г.

Авторские права: © 2008 Ueda et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Эта работа поддержана грантом на реализацию третьей всеобъемлющей 10-летней стратегии борьбы с раком, грантами на научные исследования в области здравоохранения для исследований генома человека и генной терапии от Министерства здравоохранения, Труд и благосостояние Японии, грант на научные исследования по приоритетным областям рака от Министерства образования, культуры, спорта, науки и технологий и Программа содействия фундаментальным исследованиям в области наук о здоровье Организации по фармацевтической безопасности и исследования Японии.С.У. и М.К. были награждены стипендиями для научных сотрудников Фонда содействия исследованиям рака.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Введение

ES клетки происходят из внутренней клеточной массы (ICM) бластоцист и способны к неограниченной недифференцированной пролиферации in vitro . Линии ES-клеток мыши (mES) были впервые созданы путем культивирования ICM [1], [2] в присутствии слоя питающих клеток, состоящего из эмбриональных фибробластов мыши (MEF) и факторов ингибирования лейкемии (LIF) [3].Эти клетки обладают стабильным потенциалом развития для образования производных всех трех зародышевых листков эмбриона даже после длительного культивирования [4], и их использовали для изучения механизма дифференцировки клеток. Более того, они способны генерировать химеры зародышевой линии после инъекции в бластоцисту [5]. Таким образом, создание целевой мутации у мышей стало ценным источником животных моделей болезней человека.

Крыса является эталонной животной моделью для физиологических исследований и для анализа мультигенных заболеваний человека, таких как гипертония, диабет и неврологические расстройства [6], а в обширных исследованиях химического канцерогенеза крыс использовали в течение длительного периода времени.Таким образом, клетки rES являются важным ресурсом для изучения моделей заболеваний.

Ранее сообщалось о попытках создать стабильную линию плюрипотентных ES-клеток от крыс [7], [8], [9], [10], [11]. Однако потенциал развития этих клеточных линий остается плохо изученным, и еще не было показано, что они восстанавливают зародышевую линию.

Здесь мы установили клетки rES, которые имеют все недифференцированные признаки, стабильные условия для длительного культивирования, поддерживают нормальный кариотип, поддерживают плюрипотентный потенциал дифференцироваться в производные энтодермы, мезодермы и эктодермы, и, что наиболее важно, способны производства химер.

Таким образом, наши rES-клетки станут полезным ресурсом для разработки крупных животных моделей болезней человека, регенеративной медицины и фармацевтических исследований.

Результаты

Создание и обслуживание клеточных линий Rat ES

Бластоцисты без зоны или зародыши морулы (рис. 1А) культивировали на питающем слое в течение 2 или 3 дней. В результате всего 42 ICM показали достаточный рост для субкультивирования в культуральной среде rES (RESM) (рис. 1B). Rat LIF не был абсолютно необходим в процессе роста ICM.Эти ICM были диссоциированы на кластеры клеток. Эти кластеры, полученные из некоторых эмбрионов, были смешаны и перенесены на новый питающий слой для размножения, потому что клетки должны быть высокой плотности для создания клеточных линий rES. Через несколько дней после субкультивирования колонии с сильно уплотненными кластерами клеток собирали и переносили на новый питающий слой. Клеточные линии rES стабильно поддерживались методом массового пассажа [12] с использованием как обработки коллагеназой, так и дезагрегации колоний пипетированием с использованием Pipetman P-1000.Клетки обычно пересевали каждые 3–4 дня при коэффициенте деления 1–3. После этих процедур две независимые линии ES-клеток (Ws-4 и Ws-9) (Рисунки 1C и D, Рисунки S1A и B) были изолированы, успешно размножены и использованы для детального анализа. Клетки Ws-4 rES поддерживали в присутствии LIF крысы при 1000 Ед / мл до 5 пассажа, а затем их разделили на три группы: Ws-4-1 культивировали в присутствии 250 Ед / мл крысиного LIF; Ws-4-2 культивировали в присутствии 500 Ед / мл крысиного LIF; Ws-4-3 культивировали в присутствии LIF крысы 1000 ед / мл.Ws-9 поддерживали без крысиного LIF. Эти клетки росли плоскими и имели морфологию, аналогичную линиям ES-клеток человека и обезьяны (Фигуры 1C и D, Фигуры S1A и B). Они не образовывали куполообразных колоний, характерных для клеток mES. Клетки Ws-4-3 не использовались в дальнейшем анализе, поскольку они быстро росли и легко теряли свой фенотип, подобный стволовым клеткам.

Рисунок 1. Генерация крысиных ES-клеток и экспрессия маркеров стволовых клеток.

Замороженный Jcl: бластоцисты Wister обрабатывали раствором Тирода.(B) Клетки, полученные из ICM, прикрепленные к MEF через 3 дня культивирования бластоцисты и (C и D) колонии Ws-4 при пассаже 8. Масштабная полоса 200 мкм. Экспрессия маркеров клеточной поверхности клетками Ws-4-2 в пассаже 13. (E) Nanog, (F) SSEA-1, (G) SSEA-3, (H) SSEA-4 и (J) TRA-1-81 были положительными. (I) TRA-1-60 был отрицательным. Масштабная линейка, 100 мкм. (K) Анализ экспрессии клеток rES с помощью Nanog и Oct-3/4. Уровни транскрипта были нормализованы по экспрессии GAPDH крысы, при этом уровни экспрессии MEFs были установлены как 1,0. ПЦР-анализ в реальном времени Ws-4-1 p17, Ws-4-2 p17, Ws-9 p17, MEF и mES (полученных из 129sv).Nanog (слева) и Oct-3/4 (справа) были обнаружены во всех линиях клеток rES; однако каждая линия клеток rES показывает разные уровни экспрессии.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0002800.g001

Маркеры стволовых клеток и анализ кариотипа rES-клеток

Чтобы охарактеризовать свойства выделенных клеточных линий, мы проанализировали активность щелочной фосфатазы, SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81 и Nanog методом иммуноокрашивания. ICM мыши, клетки ES и клетки EC экспрессируют SSEA-1, но не экспрессируют SSEA-3 или SSEA-4.Клетки rES Ws-4-2 экспрессировали SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-81 и Nanog при пассаже 13 (Фигуры 1E – H и J). Однако эти клетки были отрицательными по активности щелочной фосфатазы (данные не показаны) и TRA-1-60 (рис. 1I). Клетки Ws-9 rES экспрессировали SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-81 и Nanog при пассаже 12 (Фигуры S1C – F и H). Клетки Ws-9 rES также были отрицательными по активности щелочной фосфатазы (данные не показаны) и TRA-1-60 (Фигуры S1G). Их сводка представлена ​​в Таблице S1.

Затем мы исследовали экспрессию нескольких молекулярных маркеров с помощью ПЦР-анализа в реальном времени.Как и Oct3 / 4, экспрессия мРНК Nanog ограничена плюрипотентными стволовыми клетками и отсутствует в дифференцированных [13], [14]. Клетки rES Ws-4-1, Ws-4-2 и Ws-9 экспрессировали Nanog и Oct3 / 4 при пассаже 17 (фигура 1K).

Кариотип оценивали в процессе создания и длительного пассажа rES-клеток. Подсчитывали количество хромосом каждой клеточной линии, как показано на рисунке S2, и их сводные данные представлены в таблице S2. Клетки rES Ws-4-1, Ws-4-2, Ws-4-3 и Ws-9 имели более 40% нормального кариотипа при пассаже с 11 по 18.

Дифференцирующая способность

EB были получены путем культивирования агрегатов rES-клеток в чашках Петри. Ws-4-1 и Ws-9 rES клетки образовывали простые EB в течение нескольких дней (рис. 2A). Особенно, когда эти культуры поддерживались, простые EB Ws-4-2 развивали кистозные EB (Рисунок 2B).

Рисунок 2. Плюрипотентность крысиных ЭС клеток.

Формирование эмбриоидных телец (A) Ws-4-1 и (B) Ws-4-2. Масштабная линейка 200 мкм. Иммуноокрашивание, подтверждающее дифференцировку in vitro и во все три зародышевых листка (Ws-4-1).Экспрессия (C) бета-III тубулина (эктодерма), (D) цитокератина 18 (энтодерма) и (E) альфа-SMA (мезодерма). Масштабная линейка, 50 мкм. (F) Опухоль, полученная из Ws-9, после подкожной инъекции SCID-мыши. Окрашенные гематоксилином и эозином гистологические срезы опухоли, происходящей от rES (Ws-9): (G) кишечная эпителиеподобная структура (энтодерма) и (H) хрящеподобная структура (мезодерма).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0002800.g002

Чтобы более подробно изучить дифференцировочную способность rES-клеток, мы определили, могут ли rES-клетки дифференцироваться в широкий спектр типов клеток in vitro .Образование производных трех зародышевых листков из Ws-4-1 было подтверждено экспрессией маркеров, включая бета-III тубулин (нейроэктодерма) (рисунок 2C), нестин (рисунок S3A), цитокератин 18 (энтодерма) (рисунок 2D), альфа-актин гладких мышц (SMA) (мезодерма) (рисунок 2E) и CD31 (рисунок S3B). Ws-9 дифференцировался на эктодерму (бета-III тубулин, рисунок S3C) и энтодерму (CK18, рисунок S3D). Дифференцировка мезодермы от Ws-9 не тестировалась. Затем мы трансплантировали rES-клетки линий Ws-4-1, Ws-4-2 и Ws-9 соответственно мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID).Образование опухоли было обнаружено через 5–16 недель. Ws-4-1 образовывал опухоли от всех инъекций (подкожные инъекции: n = 3 и интратестикулярные инъекции: n = 1). Ws-4-2 образовал опухоль в результате подкожной инъекции (n = 1). Ws-9 сформировал опухоли от 3 подкожных инъекций (n = 5) и от 2 внутрибрюшинных инъекций (n = 6). Опухоль через 6 недель от Ws-9 была показана (фиг. 2F в виде подкожных опухолей). Эти опухоли состояли из двух зародышевых листков, включая структуру, подобную кишечному эпителию (энтодерма, рис. 2G), и структуру, подобную хрящу (мезодерма, рис. 2H).Структуры эктодермального происхождения в этих опухолях не обнаружено.

Изготовление химерных крыс

Затем мы исследовали способность клеток rES продуцировать химеры. Для этой цели использовали линии клеток rES, названные Ws-4-1, Ws-4-2 и Ws-9. Мы вводили EGFP-положительные rES-клетки (рис. S4B) в бластоцисты крыс Jcl: Wister, которые затем трансплантировали в матки псевдобеременных крыс. Мы получили в общей сложности 11 родившихся детенышей (7 живых и 4 мертвых) и 6 эмбрионов (E18.5 или E15.5) от 351 инъецированных и перенесенных бластоцист с использованием трех независимых клеточных линий (Таблица 1).Мы исследовали присутствие химерных крыс с помощью ПЦР-анализа, чтобы узнать, вносят ли rES-клетки вклад в различные органы. Это дало 10 крыс-химер (рис. 3 и таблица 1). У 3 детенышей, полученных из rES-клеток Ws-4-1, ПЦР-анализ выявил вклад rES-клеток в печень, сердце и кожу (рисунок S5A). У 4 живых детенышей от клеток rES Ws-4-2 анализ ПЦР выявил вклад rES-клеток в клетки крови, уши и хвосты (рис. 3В). Мы получили 4 эмбриона на ст. E18.5 от Ws-4-1 и 2 эмбриона на ст. Ст. 15.5 от Ws-4-2, и анализ ПЦР выявил вклад rES-клеток в 3 эмбриона (E18.5) из WS-4-1 (рисунок S5B). Крысы-химеры, полученные из клеток rES Ws-4-2, были выращены и не показали никаких отклонений от нормы (фиг. 3A). В клетках rES линии Ws-9 химерных крыс пока не получено.

Рис. 3. Вклад rES-клеток в химеры.

(A) Были получены живые крысы-химеры, полученные из клеток rES (Ws-4-2). (B) Четыре химерные крысы были получены от 2-х псевдобеременных крыс путем генотипирования клеток крови, ушей и хвостов.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0002800.g003

Обсуждение

Здесь мы впервые показываем, что мы установили клетки rES из бластоцисты крысы Wister. Наши клетки rES обладают всеми недифференцированными признаками, а именно: 1) стабильная долговременная культура возможна через 18 пассажей с сохранением более 40% нормального кариотипа; 2) экспрессируют гены, специфичные для ES-клеток, такие как Nanog и Oct3 / 4; 3) экспресс SSEA-1, -3, -4 и TRA-1-81; 4) поддерживают плюрипотентный потенциал дифференцировки в производные всех трех зародышевых листков и способны продуцировать химерных крыс.Таким образом, эти результаты определяют наши rES-клетки как линию эмбриональных стволовых клеток и будут регулярно использоваться для создания целевых мутаций, условного нокаута и замены генов, которые необходимы для создания соответствующих крупных животных моделей для физиологии человека, болезней, регенеративной медицины и фармацевтики. исследовать.

Мы создали и охарактеризовали две независимые линии клеток ES. Интересно, что морфология rES была подобна ES-клеткам приматов, о которых сообщалось до сих пор, и клетки образовывали более плоские колонии, чем типичные куполообразные колонии mES-клеток.Подобно ES-клеткам приматов, rES-клетки демонстрировали очень низкую эффективность посева при диссоциации на отдельные клетки.

В случае ES-клеток яванского макака дифференцированные клетки были значительно уменьшены при замене FBS на KSR [15]. Кроме того, сообщалось, что bFGF увеличивает эффективность клонирования человеческих ES (hES) клеток [16]. Однако клетки rES не были созданы, и скорость роста в среде KSR была ниже, чем в среде FBS с крысиным bFGF или без него.

Поддержание недифференцированного состояния и плюрипотентности в mES-клетках требует присутствия фидерных слоев MEF или LIF.Известно, что LIF связывается со своим рецептором LIFR, который гетеродимеризуется с передающим сигнал рецептором gp130. Плюрипотентность mES зависит от последующих внутриклеточных сигнальных событий, включая фосфорилирование тирозинкиназ семейства Janus (JAK), которое приводит к активации белка-преобразователя сигнала STAT3 [17]. LIFR, IL6R и gp130 экспрессировались на клетках hES и при стимуляции либо LIF, либо IL-6 активировали STAT3. Однако повышенные уровни активации STAT3, стимулированной gp130, не смогли поддерживать hES-клетки в недифференцированном состоянии с прогрессирующей потерей экспрессии TRA-1-60, Nanog и Oct4 [18].LIFR был экспрессирован на наших клетках rES (Рисунок S6). Мы клонировали полную кДНК LIF крысы и определили нуклеотидную последовательность [19] из-за неспособности рекомбинантного LIF мыши сохранять плюрипотентный фенотип клеток rES в течение длительного времени. Хотя LIF крысы не был необходим для роста ICM и его размножения, LIF крысы был важен для поддержания уровней экспрессии Nanog как эквивалента клеток mES. Nanog экспрессировался на более низких уровнях в линии Ws-4-1 (250 Ед / мл LIF крысы) и Ws-9 (0 Ед / мл LIF крысы), чем в клетках mES.Сообщается, что увеличение или уменьшение на 50% белков Oct3 / 4 вызывает дифференцировку ES-клеток [20]. Экспрессия Oct3 / 4 резко увеличивалась в Ws-4-1 и снижалась в Ws-9. Эти данные позволяют предположить, что LIF крысы полезен для поддержания недифференцированного состояния и плюрипотентности rES-клеток в течение длительного периода.

Когда mES-клетки выращивают в бессывороточной среде, BMP4 и LIF действительно могут поддерживать образование линии ES-клеток, поддержание плюрипотентности, колонизацию химер и свойства передачи зародышевой линии [21].Мы обнаружили, что рецептор BMP4 экспрессируется на клетках rES (Рисунок S6). Мы исследовали, может ли добавление крысиного LIF и человеческого BMP4 способствовать самообновлению и ингибированию дифференцировки rES-клеток. Ws-9 поддерживали без крысиного LIF. Клетки Ws-9 высевали на MEF в среде rES с крысиным LIF (500 ед / мл), человеческим BMP4 (10 нг / мл) или крысиным LIF плюс человеческим BMP4. После 4-го и 8-го дня статус клеток rES подтверждался экспрессией мРНК для факторов транскрипции, специфичных для ES-клеток, Nanog, Oct3 / 4 и Sox2.Мы обнаружили значительную индукцию экспрессии Oct3 / 4 в присутствии одного крысиного LIF, а также крысиного LIF плюс BMP4 на 8 день в культуре (фигура S7). Напротив, экспрессия Sox2 снижалась одним LIF крысы, а также LIF крысы плюс BMP4 человека. Экспрессия Nanog не увеличивалась под действием LIF крысы, человеческого BMP4 или крысиного LIF плюс человеческий BMP4. Эти данные предполагают, что 500 Ед / мл крысиного LIF и 10 нг / мл человеческого BMP4 недостаточны для поддержания наших клеток rES для экспрессии Oct3 / 4, Nanog и Sox2.

Наши клетки rES экспрессировали некоторые маркеры стволовых клеток.Однако паттерны экспрессии антигенов SSEA у некоторых видов различаются. Паттерны экспрессии антигенов SSEA в крысинских клетках EC и ICM недостаточно документированы. Ws-9 был отрицательным для SSEA-1 и TRA-1-81 и слабо окрашивался на Nanog на 30-м пассаже, но сохранял экспрессию SSEA-3 (данные не показаны). Эти результаты предполагают, что дифференцированные клетки окрашиваются на SSEA-3.

Oct3 / 4, Sox2 и Nanog, как было показано, действуют как основные факторы транскрипции при поддержании плюрипотентности [22], [23].Клетки rES экспрессировали Oct3 / 4 и Nanog. Любопытно, что активность щелочной фосфатазы, которая обычно маркирует плюрипотентные клетки, присутствовала в клетках hES и mES, но резко исчезла при культивировании и не определялась в клетках rES. Активность щелочной фосфатазы сохраняется в первичных половых клетках [24], [25] в гаструлирующем эмбрионе [26] и в их производных in vitro, , эмбриональных половых клетках. Гены, связанные с зародышевой линией, включая Stella , Piwil2 , Stra8 и Dazl , экспрессировались клетками mES и значительно снижались или не обнаруживались в клетках hES. Stella и Piwil2 не были увеличены в клетках rES по результатам анализа микрочипов (фигура S8B). Однако клетки rES экспрессировали Vasa (рис. S6), который присутствует во фетальных и взрослых половых клетках гонад как у мужчин, так и у женщин и наиболее часто встречается в сперматоцитах и ​​зрелых ооцитах [27], [28]. Эти данные предполагают, что клетки rES могут обладать дифференцирующей способностью к клонированию зародышевых клеток.

Наши клеточные линии rES имели нормальное количество хромосом на ранних пассажах, но приводили к быстрому накоплению хромосомных аномалий в поздних пассажах.Известно, что высокие показатели анеуплоидии наблюдаются в клетках hES во время пассажа в культуре. В частности, растворы на основе трипсина имеют тенденцию вызывать чрезмерную диссоциацию ES-клеток на отдельные клетки, и это может способствовать кариотипическим аномалиям [29]. Ранее нам удалось создать линии клеток rES от крысы Wistar Hannover GALAS. Полученные клетки Wistar Hannover GALAS rES имели недифференцированные признаки; однако в этих клетках развивались кариотипические аномалии во время пассажа в культуре с использованием трипсина (данные не показаны).Эти аномалии связаны со сниженной способностью клеток к колонизации зародышевой линии в химерах, полученных после инъекции бластоцисты [30], [31]. Однако сообщается, что кариотип и способность in vitro дифференцировать mES-клеток влияют на их вклад в зародышевую линию химерных мышей. То, что оба демонстрируют примерно 40% нормального кариотипа и образование кистозных EB в течение 7 дней после суспензионного культивирования, является возможным показателем их способности передавать зародышевую линию у химерных мышей [32].В наших клетках rES Ws-4-1, Ws-4-2 на 11-13 пассажах и клеточные линии Ws-9 на 18 пассажах сохраняли более 40% нормального кариотипа, и все они образовывали EB в течение нескольких дней, что указывает на то, что они обладают способностью способствовать передаче через зародышевую линию. Фактически, наши rES-клетки дифференцировались на три зародышевых листка in vitro : нейроны, эпителиальные клетки и гладкомышечные клетки. Исследование тканевой дифференцировки в тератомах, полученных из клеток rES, выявило более широкую дифференцировочную способность.

Наши клетки rES могут способствовать образованию химер при введении в бластоцисты. Для дальнейшего анализа передачи по зародышевой линии 4 живые химеры, полученные из Ws-4-2, были скрещены с нормальными самцами или самками. Поскольку клетки rES не выживают так же хорошо, как отдельные клетки, мы исследовали их способность вносить вклад в эмбриогенез посредством диплоидной (4 ~ 16 клеток, n = 54) агрегации и тетраплоидной (2 ~ 8 клеток, n = 38) агрегации с использованием клеток rES. линия WS-9. Когда rES-клетки были агрегированы с диплоидом или тетраплоидом и перенесены в яйцеводы самок-реципиентов, мы не получили детенышей (данные не показаны).Для проверки способности к развитию 89 свободных от зоны 2-клеток без rES-клеток культивировали в течение 3 дней и переносили в яйцеводы самок-реципиентов. Но щенков не было. Эти результаты предполагают, что эмбрионы крыс, свободные от зоны, культивированные in vitro , способны развиваться до стадии бластоцисты; однако постимплантационное развитие не завершено. Методы агрегации могут не подходить для получения химерных крыс.

Недавно плюрипотентные стволовые клетки были получены из слоя позднего эпибласта постимплантационных (EpiSCs) эмбрионов мыши и крысы [33], [34].Похоже, что они очень близко соответствуют человеческим, а не мЭС-клеткам. Единственным исключением является то, что EpiSC не обладают активностью щелочной фосфатазы. Они не зависят от LIF и BMP4 и вместо этого требуют активин / узелок и FGF для эффективного самообновления. EpiSCs могут плохо влиять на химеры после инъекции бластоцисты, но передачи по зародышевой линии не наблюдалось. EpiSCs представляют собой ценную экспериментальную систему для определения того, отражают ли различия между ES-клетками мыши и человека видовые различия или различное временное происхождение.Клетки rES, происходящие из ICM, имеют морфологию, аналогичную клеткам hES. Клетки rES, вероятно, улучшат наше понимание различий между мышами и крысами. Чтобы дополнительно охарактеризовать наши клетки rES, характер экспрессии генов в двух зависимых линиях клеток rES и клеток mES оценивали с помощью массивов экспрессии всего генома. В результате был проведен кластерный анализ всего генома путем сортировки 3943 измененных генов. Уровень экспрессии каждого гена в MEF, обработанном MMC (для клеток mES) или обработанном MMC эмбриональном фибробласте крысы (REF: для клеток rES), был установлен на 1.0. Кластерный анализ показал, что независимо полученные линии rES были подобны (коэффициенты корреляции: 0,95795) и отличны от клеток mES (коэффициенты корреляции: 0,12554) (рисунок S8A). Чтобы подтвердить результаты анализа микрочипов, мы сосредоточили внимание на нескольких генах, связанных с ICM, mES, EpiSC, hES [34]. Наши данные показывают, что уровень экспрессии активированных генов в клетках mES, таких как cdh2 / E-cadherin , Otx2 , Cldn6 , Nodal , Sox17 , Foxa2, Acvr2b, Pitx2 и Dkk1 также были активированы в наших клетках rES.С другой стороны, наши данные показывают, что гены значительно увеличились в клетках mES, таких как Dppa3 / Stella, Fbxo15, Lefty2, Nr01 / Dax1 и Sox2 , были незначительно или не увеличены в клетках rES (Рисунок S8B и Таблица S3). . Таким образом, анализ микроматрицы показывает, что профиль экспрессии генов наших rES-клеток частично напоминает mES-клетки. Кроме того, с использованием базы данных (инвентарный номер GEO GSE7902) характер экспрессии клеток rES сравнивали с таковым из клеток mES и EpiSCs [34].Кластерный анализ клеток rES, клеток mES и EpiSCs был выполнен путем сортировки 2866 измененных генов, общих для крыс и мышей. Кластерный анализ путем сортировки 2866 измененных генов показал, что независимо полученные линии rES были сходными (коэффициенты корреляции: 0,80782). Кластерный анализ показал, что EpiSC не были подобны клеткам mES (коэффициенты корреляции: 0,42110) и отличны от клеток rES (коэффициенты корреляции: 0,22710). Кластерный анализ mES-клеток с использованием базы данных показал, что mES-клетки не были похожи на rES-клетки (коэффициенты корреляции: 0.36524) (данные не показаны).

В этом отчете мы установили клеточные линии rES, которые поддерживают плюрипотентный потенциал и нормальное количество хромосом. И мы получили крыс-химер, полученных из клеток rES путем генотипирования. Способность этих клеток вызывать передачу по зародышевой линии в настоящее время исследуется. Наши результаты открывают путь для более обширных генетических модификаций, таких как условный нокаут и замена генов, которые необходимы для создания соответствующих моделей заболеваний человека.

Материалы и методы

Rat ES средний

Культуральная среда Rat ES (RESM) состояла из 1-1 смеси модифицированной Дульбекко среды Игла (DMEM) и питательной смеси Хэма F-12 (DMEM / F-12, Gibco) с добавлением 3% фетальной бычьей сыворотки (Gibco), 0,1 мМ 2-меркаптоэтанол (Sigma), 1% запаса заменимых аминокислот (Gibco), 2 мМ L-глутамина (Gibco), 1 мМ пирувата натрия (Gibco), 1 × антибиотик-антимикотик (Gibco), 1 × исходный нуклеозид (Sigma ) (100 ×: аденозин (0,8 мг / мл), гуанозин (0.85 мг / мл), цитидин (0,73 мг / мл), уридин (0,73 мг / мл) и тимидин (0,24 мг / мл)).

Создание и обслуживание клеточных линий Rat ES

Замороженные эмбрионы Jcl: эмбрионы Wister были приготовлены CLEA Japan, Inc. Бластоцисты (n = 37) и морулы (n = 14) обрабатывались раствором Тирода (Ark Resource Co. Ltd.) и промывались средой Quinn's Advantage Blastocyst Medium (SAGE In -Vitro Fertilization, Inc. A Cooper Surgical Company) с добавлением 3% KSR (Gibco). От семи до десяти эмбрионов без зон на чашку диаметром 60 мм помещали на эмбриональные фибробласты мыши, инактивированные митомицином С (MEFs, Millipore) в RESM.Через 2 или 3 дня клетки, полученные из ICM, диссоциировали на комки путем воздействия 0,025% трипсина (линия клеток Ws-4) или 0,05% коллагеназы типа IV (Gibco) в DMEM / F-12 и механической диссоциации (линия клеток Ws- 9) с помощью инструмента для вырезания стволовых клеток (SWEMED Lab International AB; Billdal, Швеция) перед переносом на новый питающий слой. Колонии с морфологией, подобной стволовым клеткам, собирали, диссоциировали 0,05% коллагеназы типа IV, механически диссоциировали и переносили в питающий слой для размножения.После создания клетки rES обычно пассировали каждые 3-4 дня до 5 пассажей в RESM в присутствии крысиного LIF (Millipore / Chemicon International) в концентрации 1000 Ед / мл, а затем их культивировали в RESM с добавлением 250 Ед / мл. , 500 Ед / мл или 1000 Ед / мл крысиного LIF (линия клеток Ws-4 rES) или без крысиного LIF (линия клеток Ws-9 rES). Подсчет числа хромосом производился на пассаже с 10 по 18.

Гистохимический анализ маркеров стволовых клеток

Активность щелочной фосфатазы определяли с помощью субстрата Vector Blue (Vector Labs).SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81 (Millipore) и Nanog (ReproCELL, Япония) были обнаружены иммуноцитохимическим методом. Клетки фиксировали в 4% параформальдегиде, затем инкубировали в течение 1 часа в блокирующем растворе (изображение iT, Invitrogen). Первичные антитела наносили на ночь при 4 ° C. Вторичные антитела, конъюгированные с флуорофорами Alexa (молекулярный зонд), при разведении 1-1000 инкубировали с клетками в течение 1,5 часов при комнатной температуре.

ПЦР в реальном времени

Тотальную РНК выделяли с использованием ISOGEN (Nippongene, Tokyo, Japan), и образцы обрабатывали ДНКазой I (Takara).КДНК получали из 2 мкг общей РНК с использованием праймеров Super Script III RT (Invitrogen) и олиго-dT (Invitrogen).

кДНК использовали для ПЦР с использованием Platinum SYBR Green qPCR SuperMix UDG (Invitrogen). Оптимизацию реакции qRT-PCR проводили в соответствии с инструкциями производителя (PE Applied Biosystems, Токио, Япония). Все количественные определения были нормализованы к эндогенному контролю GAPDH. Значения относительной индукции генов были рассчитаны в соответствии с инструкциями производителя.Использовали следующие праймеры: Nanog , прямой, 5'-GCCCTGATTCTTCTAGCAAT-3 'и обратный, 5'-AGAACACAGTCCGCATCTT-3'; Oct3 / 4 , прямой, 5'-CATCTGCCGCTTCGAG-3 'и обратный, 5'-CTCAATGCTAGTCCGCTTTC-3'; крыса Gapdh , прямой, 5'-TTCAACGGCACAGTCAAGG-3 'и обратный, 5'-CATGGACTGTGGTCATGAG-3'.

Анализ дифференцирующей способности

Потенциал развития rES-клеток был оценен in vitro и путем образования EB. Колонии клеток rES собирали с коллагеназой IV, осторожно растирали и культивировали в течение 5–10 дней в чашках для суспензионных культур (Zarstat), содержащих RESM без LIF крысы.

Для дифференциации клеток rES в нервные клоны EB поддерживали в течение 2-3 дней в RESM без крысиного LIF и в течение 3-4 дней в RESM с 10 -6 M ретиноевой кислоты (Sigma). EB обрабатывали 0,25% трипсином-EDTA. Диспергированные клетки собирали центрифугированием и повторно высевали на покрытые поли-L-орнитином (Sigma) предметные стекла с 4 лунками Lab Tech II (BD) в среде B27 (DMEM / F12 [1-1] с добавкой B27 (Invitrogen) 5 мМ буфер HEPES (Sigma), 2 мкг / мл гепарина (Sigma), антибиотик-антимикотик (Invitrogen) и 1% FBS.

Для дифференцировки клеток rES в энтодерму и мезодерму клетки rES культивировали в отсутствие MEF на покрытой желатином пластине в RESM без LIF крысы.

Клетки фиксировали в 4% параформальдегиде в фосфатно-солевом буфере (PBS) в течение 20 мин при комнатной температуре. Фиксированные клетки блокировали в течение 1 часа при комнатной температуре с помощью PBS / 0,1% BSA / 10% нормальной козьей сыворотки / 0,3% Triton X-100 для бета-III тубулина и альфа-SMA или PBS / 0,1% BSA / 10% нормальной козьей сыворотки. для цитокератина 18 (CK18), затем инкубировали в течение ночи с тубулином против бета-III (COVANCE) при 1–2000, анти-альфа-SMA (SIGMA) при 1–1000 или антителом против CK18 (Millipore) при 1–50.Вторичные антитела, конъюгированные с флуорофорами Alexa (молекулярный зонд), при разведении 1-1000 инкубировали с клетками в течение 1,5 часов при комнатной температуре. Окрашенные клетки анализировали с использованием флуоресцентного микроскопа HS All-in-one (KEYENCE Corporation, Япония) и ECLIPSE TE300 (Nikon Corporation, Япония).

Клетки rES также были протестированы на их способность образовывать тератомы. Приблизительно 10 7 клеток rES вводили подкожно или 10 6 –8 × 10 6 клеток rES вводили интратестикулярно или внутрибрюшинно в C.Мыши B17 / Icr-scid (scid / scid) (CLEA Japan, Inc.). Тератомы иссекали, когда образование опухоли становилось очевидным. Их фиксировали в 10% -ном формалине или ацетоне с фосфатным буфером. И они были обработаны для заливки парафином для гистологического наблюдения.

Эксперименты на животных в настоящем исследовании были выполнены в соответствии с рекомендациями Института исследований лабораторных животных, Национального исследовательского института онкологического центра.

Трансдукция лентивируса в клетки ES

Лентивирус-зеленый флуоресцентный белок (LV-GFP), который несет кассету экспрессии для eGFP, был сконструирован с помощью pLenti6 (Invitrogen).Клетки rES инфицировали LV-GFP с moi 250 или 500 в течение ночи в объеме 500 мкл. EGFP-положительные колонии отбирали и культивировали на новом питающем слое.

Инъекция бластоцисты

Бластоцисты были извлечены из матки естественных вязок самок Jcl: Wister через 4,5 дня после полового акта (d.p.c.). Бластоцисты помещали в каплю HEPES (Nakamedical) под минеральным маслом. Клетки rES вводили в полость бластоцисты с помощью пипетки для микроинъекций.После инъекции бластоцисты возвращали в среду mW (Mitsubishi Kagaku Iatron, Inc.) и помещали при 37 ° C до передачи самкам-реципиентам. От 14 до 21 инъецированных бластоцист переносили в каждый рог матки на 4,5 d.p.c. псевдобеременных Jcl: крысы Wister. Всего rES-клетки Ws-4-1, Ws-4-2 и Ws-9 вводили в 351 бластоцисту и их подвергали маточному переносу.

Генотипирование

Потомство проверяли на наличие гена EGFP с помощью ПЦР.Клетки крови, уха и хвоста детенышей и каждая ткань новорожденных погибали при 15,5 или 18,5 d.p.c. лизировали в 50 мМ Tris-HCl, pH 8,2, содержащем 25 мМ EDTA, 0,5% SDS, 10 мМ NaCl и 1 мг / мл протеиназы K. ПЦР проводили в следующих условиях: EGFP, 95 ° C, 30 с, 58 ° C 30 с, 72 ° C 20 с (40 циклов) и GAPDH, 95 ° C 30 с, 60 ° C 30 с, 72 ° C 30 с (25 циклов). Праймерами были EGFP, прямой, 5'-CTGACCCTGAAGTTCATCTG-3 'и обратный, 5'-TCCTTGAAGTCGATGCCCTT-3'; крыса Gapdh , прямой, 5'-TTCAACGGCACAGTCAAGG-3 'и обратный, 5'-CATGGACTGTGGTCATGAG-3'.

Дополнительная информация

Рисунок S1.

Генерация крысиных ES-клеток и экспрессия маркеров стволовых клеток. (A и B) Колонии Ws-9 в пассаже 11. Шкала шкалы, 200 мкм Экспрессия маркеров клеточной поверхности клетками Ws-9 в пассаже 12. (C) Наног, (D) SSEA-1, (E) SSEA-3 , (F) SSEA-4 и (H) TRA-1-81 были положительными. (G) TRA-1-60 был отрицательным. Масштабная линейка, 50 мкм

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0002800.s004

(1,56 МБ TIF)

Рисунок S3.

Клетки rES могут дифференцироваться in vitro в самые разные типы клеток. Иммуноокрашивание, подтверждающее дифференцировку in vitro. Экспрессия (A) нестина (эктодерма) и (B) CD31 (мезодерма) наблюдалась в дифференцированном Ws-4-1. Экспрессия (C) β-III тубулина (эктодерма) и (D) CK18 (энтодерма) наблюдалась в дифференцированном Ws-9.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0002800.s006

(1,56 МБ TIF)

Рисунок S4.

rES-клеток, трансдуцированных LV-GFP.(A и B) EGFP-положительные колонии (линия Ws-9) собирали и вводили в бластосисты. (C и D) Кистозные EB были продуцированы EGFP-положительными клетками Ws-9. Шкала шкалы: 100 мкм. (E и F) EGFP-положительный rES (линия Ws-9) вызывал опухоли после внутрибрюшинной инъекции.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0002800.s007

(1,56 МБ TIF)

Рисунок S5.

Вклад rES-клеток (Ws-4-1 и Ws-9) при генотипировании. (A) Три химерных крысы были получены из Ws-4-1, и химерные крысы не были получены из Ws-9.(B) Три химерных эмбриона (E18.5) были получены из Ws-4-1. pCAG-EGFP - вектор с геном EGFP, положительный контроль.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0002800.s008

(1,56 МБ TIF)

Рисунок S6.

Анализ экспрессии генов Lifr и Vasa крыс в клетках rES с помощью ОТ-ПЦР. Тотальную РНК выделяли с использованием ISOGEN (Nippongene, Tokyo, Japan), а образцы обрабатывали ДНКазой I (Takara). кДНК получали из 2 мкг общей РНК с использованием праймеров Super Script III RT (Invitrogen) и oligo-dT (Invitrogen).кДНК амплифицировали с помощью TaKaRa Ex Taq Hot Start Version (Takara, Japan) с использованием специфичных для генов праймеров. Были использованы следующие праймеры: крысиный Lifr, прямой, 5'-CTGTCATTGTTGGCGTGGTA-3 'и обратный, 5'-GATTCCAGGACTTCGACGTG-3', 30 циклов; крысиный Vasa, прямой, 5'-TTGGGCACTCAATTCGAC-3 'и обратный, 5'-AACTTCTTCATTTCGGGTCC-3', 32 цикла; крысиный Bmpr1a, прямой, 5'-CCATTTCCAGCCCTACATCA-3 'и обратный, 5'-TTCCAGCGGTTAGAGACGAT-3', 35 циклов.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0002800.s009

(1.56 МБ TIF)

Рисунок S7.

Анализ экспрессии клеток rES Oct3 / 4 и Sox2 в ответ на LIF, BMP4 или LIF плюс BMP4. Ws-9 поддерживали без крысиного LIF. 5 × 10 4 клеток Ws-9 на лунку высевали на MEF покрытых желатином 6-луночных планшетов в RESM. Условия культивирования были разделены на четыре группы: 1) крысиный LIF (-) и человеческий BMP4 (-), 2) крысиный LIF (-) и человеческий BMP4 (10 нг / мл), 3) крысиный LIF (500 Ед / мл) и человеческий BMP4 (-), 4) LIF крысы (500 Ед / мл) и BMP4 человека (10 нг / мл).После 4-го дня клетки rES пассировали 5 × 10 4 / лунку. Анализ ПЦР в реальном времени Ws-9 p14 (день 4), p15 (день 8) и MEF. кДНК использовали для ПЦР с использованием Platinum SYBR Green qPCR SuperMix UDG (Invitrogen). Оптимизацию реакции qRT-PCR проводили в соответствии с инструкциями производителя (PE Applied Biosystems, Токио, Япония). Использовали следующие праймеры: Oct3 / 4, прямой, 5'-CATCTGCCGCTTCGAG-3 'и обратный, 5'-CTCAATGCTAGTCCGCTTTC-3'; Sox2, прямой, 5'-CCCACCTACAGCATGTCCTA-3 'и обратный, 5'-TGGAGTGGGAGGAAGAGGTA-3'; rat Gapdh, прямой, 5'-TTCAACGGCACAGTCAAGG-3 'и обратный, 5'-CATGGACTGTGGTCATGAG-3'.Уровни транскриптов нормализовали по экспрессии GAPDH крысы, а уровни экспрессии клеток rES, культивируемых без LIF крысы и BMP4 человека, на 4 день устанавливали равными 1,0. Результаты представляют собой среднее значение двух ПЦР-анализов в реальном времени. Экспрессия Oct3 / 4 (красный) увеличивалась в LIF крысы и LIF + человеческий BMP4 крысы, однако экспрессия Sox2 (синий) не повышалась.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0002800.s010

(1,56 МБ TIF)

Рисунок S8.

Анализ микрочипов и иерархический кластерный анализ.В соответствии с инструкциями производителя использовали одноцветную систему анализа экспрессии генов на основе микрочипов (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния), содержащую 41 000 генов. Полную РНК экстрагировали из MEF, обработанных MMC, клеток mES (полученных из 129sv, p6), эмбриональных фибробластов крысы, обработанных MMC (REF, 3Y1-B, p5) [19], Ws-4-2 (p17), Ws-4- 2 (стр. 14) и WS-9 (стр. 17). Процесс гибридизации и отмывки выполняли с использованием Gene Expression Wash Pack (Agilent Technologies) и ацетонитрила (Sigma, Токио, Япония).Для сканирования массива использовали сканер микрочипов ДНК (Agilent Technologies). Нормализацию данных и кластерный анализ выполняли с помощью программного обеспечения GeneSpring GX (Agilent Technologies). Уровень экспрессии каждого гена в MEF, обработанном MMC (для клеток mES) или обработанном MMC REF (для клеток rES), использовали в качестве эталона. Данные микроматрицы мыши и крысы были интегрированы через GeneSymbol, и пропущенные значения опускались. Это привело к матрице данных из 3943 генов. Иерархический кластер был создан с использованием расчета евклидова расстояния на основе расчета метода Уорда.(A) Кластерный анализ был выполнен путем сортировки 3943 измененных генов. Красный цвет указывает на повышенную экспрессию по сравнению с уровнями MEF, обработанного MMC, или обработанного MMC REF, тогда как зеленый означает снижение экспрессии. Указаны коэффициенты корреляции. Этот анализ данных микроматрицы показывает, что существуют различные кластеры генов между клетками rES и клетками mES. (B) Экспрессия генов для поддержания плюрипотентного состояния mES-клеток, EpiSC или hES-клеток. Названия генов, показанные красным, были обнаружены в культурах клеток hES и EpiSC с использованием полногеномных микрочипов Illumina и Agilent [34].Этот анализ микроматрицы показывает, что профиль экспрессии генов наших rES-клеток частично напоминает mES-клетки.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0002800.s011

(1,56 МБ TIF)

Благодарности

Мы благодарны д-ру Томоюки Шираи из Высшей школы медицинских наук Университета Нагоя (Нагоя, Япония) за гистологическое исследование. Мы также благодарим доктора Юсуке Ямамото, г-жу Аяко Иноуэ, г-жу Махо Кодама и г-жу Акеми Сугай за техническую помощь.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: SU TO. Проведены эксперименты: SU MK TS YT HO HK. Проанализированы данные: SU HT. Внесенные реактивы / материалы / инструменты анализа: СУ ТТ. Написал бумагу: SU TO.

Ссылки

  1. 1. Эванс М.Дж., Кауфман М.Х. (1981) Создание в культуре плюрипотенциальных клеток из эмбрионов мыши. Природа 292: 154–156.
  2. 2. Мартин Г.Р. (1981) Выделение линии плюрипотентных клеток из ранних эмбрионов мыши, культивированных в среде, кондиционированной стволовыми клетками тератокарциномы.Proc Natl Acad Sci U S A 78: 7634–7638.
  3. 3. Уильямс Р.Л., Hilton DJ, Пиз С., Уилсон Т.А., Стюарт С.Л. и др. (1988) Фактор ингибирования миелоидного лейкоза поддерживает потенциал развития эмбриональных стволовых клеток. Nature 336: 684–687.
  4. 4. Томсон Дж. А., Маршалл В. С. (1998) Эмбриональные стволовые клетки приматов. Curr Top Dev Biol 38: 133–165.
  5. 5. Bradley A, Evans M, Kaufman MH, Robertson E (1984) Формирование химер зародышевой линии из клеточных линий тератокарциномы, полученных из эмбрионов.Nature 309: 255–256.
  6. 6. Джейкоб Х.Дж., Квитек А.Е. (2002) Генетика крыс: привязка физиологии и фармакологии к геному. Nat Rev Genet 3: 33–42.
  7. 7. Iannaccone PM, Taborn GU, Garton RL, Caplice MD, Brenin DR (1994) Плюрипотентные эмбриональные стволовые клетки крысы способны продуцировать химеры. Дев Биол 163: 288–292.
  8. 8. Оухиби Н., Салливан Н.Ф., Инглиш Дж., Колледж У.Х., Эванс М.Дж. и др. (1995) Начальное культивирование бластоцист крысы на выбранных линиях питающих клеток.Мол Репрод Дев 40: 311–324.
  9. 9. Stranzinger GF (1996) Эмбриональные стволовые клетки, подобные клеточным линиям видов крыс и Bovinae. Int J Exp Pathol 77: 263–267.
  10. 10. Бренин Д., Смотри Дж., Бадер М., Хубнер Н., Леван Г. и др. (1997) Эмбриональные стволовые клетки крысы: отчет о прогрессе. Transplant Proc 29: 1761–1765.
  11. 11. Васильева С., Гуан К., Пич У., Вобус А.М. (2000) Создание линий эмбриональных стволовых клеток крыс, экспрессирующих SSEA-1 и Oct-4, и влияние цитокинов семейства IL-6 на рост клонов.Exp Cell Res 258: 361–373.
  12. 12. Суэмори Х., Ясучика К., Хасегава К., Фудзиока Т., Цунэёси Н. и др. (2006) Эффективное создание линий эмбриональных стволовых клеток человека и долгосрочное поддержание стабильного кариотипа путем ферментативного массового пассажа. Biochem Biophys Res Commun 345: 926–932.
  13. 13. Мицуи К., Токудзава Ю., Ито Х, Сегава К., Мураками М. и др. (2003) Гомеопротеин Nanog необходим для поддержания плюрипотентности эпибластов мыши и ES-клеток.Ячейка 113: 631–642.
  14. 14. Чемберс I, Колби Д., Робертсон М., Николс Дж., Ли С. и др. (2003) Клонирование функциональной экспрессии Nanog, фактора поддержания плюрипотентности в эмбриональных стволовых клетках. Ячейка 113: 643–655.
  15. 15. Суэмори Х., Тада Т., Тории Р., Хосой Ю., Кобаяши К. и др. (2001) Создание линий эмбриональных стволовых клеток из бластоцист яванского макака, полученных с помощью ЭКО или ИКСИ. Дев Дин 222: 273–279.
  16. 16. Амит М., Карпентер М.К., Инокума М.С., Чиу С.П., Харрис С.П. и др.(2000) Клонированные линии эмбриональных стволовых клеток человека сохраняют плюрипотентность и пролиферативный потенциал в течение длительных периодов культивирования. Дев Биол 227: 271–278.
  17. 17. Smith AG (2001) Стволовые клетки, полученные из эмбрионов: мышей и людей. Annu Rev Cell Dev Biol 17: 435–462.
  18. 18. Хамфри Р.К., Битти Г.М., Лопес А.Д., Букай Н., Кинг С.С. и др. (2004) Поддержание плюрипотентности в эмбриональных стволовых клетках человека не зависит от STAT3. Стволовые клетки 22: 522–530.
  19. 19.Такахама Й, Очия Т., Сасаки Х., Баба-Торияма Х., Кониси Х. и др. (1998) Молекулярное клонирование и функциональный анализ кДНК, кодирующей фактор ингибирования лейкемии крыс: в направлении создания плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток крысы. Онкоген 16: 3189–3196.
  20. 20. Niwa H, Miyazaki J, Smith AG (2000) Количественная экспрессия Oct-3/4 определяет дифференцировку, дедифференцировку или самообновление ES-клеток. Нат Генет 24: 372–376.
  21. 21. Ying QLNJ, Chambers I, Smith A (2003) Индукция BMP белков Id подавляет дифференцировку и поддерживает самообновление эмбриональных стволовых клеток в сотрудничестве с STAT3.Ячейка 115: 281–292.
  22. 22. Бойер Л.А., Ли Т.И., Коул М.Ф., Джонстон С.Е., Левин С.С. и др. (2005) Основная схема регуляции транскрипции в эмбриональных стволовых клетках человека. Ячейка 122: 947–956.
  23. 23. Loh YH, Wu Q, Chew JL, Vega VB, Zhang W и др. (2006) Транскрипционная сеть Oct4 и Nanog регулирует плюрипотентность в эмбриональных стволовых клетках мыши. Нат Генет 38: 431–440.
  24. 24. Резник Дж. Л., Бикслер Л. С., Ченг Л., Донован П. Дж. (1992) Долгосрочная пролиферация примордиальных зародышевых клеток мыши в культуре.Nature 359: 550–551.
  25. 25. Мацуи Й., Зебо К., Хоган Б.Л. (1992) Получение плюрипотенциальных эмбриональных стволовых клеток из примордиальных зародышевых клеток мыши в культуре. Ячейка 70: ​​841–847.
  26. 26. Де Фелиси М., Макларен А. (1982) Выделение первичных половых клеток мыши. Exp Cell Res 142: 476–482.
  27. 27. Фудзивара Ю., Комия Т., Кавабата Х., Сато М., Фудзимото Х. и др. (1994) Выделение гена белка семейства DEAD, который кодирует мышиный гомолог Drosophila vasa, и его специфическая экспрессия в клонах зародышевых клеток.Proc Natl Acad Sci U S A 91: 12258–12262.
  28. 28. Комия Т., Танигава Ю. (1995) Клонирование гена семейства белков DEAD-бокса, который специфически экспрессируется в зародышевых клетках крыс. Biochem Biophys Res Commun 207: 405–410.
  29. 29. Brimble SN, Zeng X, Weiler DA, Luo Y, Liu Y и др. (2004) Кариотипическая стабильность, генотипирование, дифференциация, поддержание без питания и выборка экспрессии генов в трех линиях эмбриональных стволовых клеток человека, полученных до 9 августа 2001 г.Стволовые клетки Dev 13: 585–597.
  30. 30. Longo L, Bygrave A, Grosveld FG, Pandolfi PP (1997) Хромосомный состав эмбриональных стволовых клеток мыши является предиктором химеризма соматических и зародышевых клеток. Transgenic Res 6: 321–328.
  31. 31. Лю X, Wu H, Loring J, Hormuzdi S, Disteche CM и др. (1997) Трисомия восемь в ES-клетках является общей потенциальной проблемой при нацеливании генов и препятствует передаче зародышевой линии. Дев Дин 209: 85–91.
  32. 32. Судзуки Х., Камада Н., Уэда О, Джишаге К., Курихара Й. и др.(1997) Вклад эмбриональных стволовых клеток в зародышевые линии химерных мышей: влияние кариотипа и способности дифференцировки in vitro. Exp Anim 46: 17–23.
  33. 33. Бронс И.Г., Смитерс Л.Е., Троттер М.В., Рагг-Ганн П., Сан Б. и др. (2007) Получение плюрипотентных стволовых клеток эпибласта из эмбрионов млекопитающих. Природа 448: 191–195.
  34. 34. Тесар П.Дж., Ченовет Дж.Г., Брук Ф.А., Дэвис Т.Дж., Эванс Е.П. и др. (2007) Новые клеточные линии эпибласта мыши имеют общие черты с эмбриональными стволовыми клетками человека.Природа 448: 196–199.
.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.