Перейти к содержимому

Пропалин для собак: ПРОПАЛИН инструкция по применению, состав, показания, противопоказания, побочные эффекты – раствор для перорального применения

Содержание

Пропалин


Описание

Пропалин 5% для орального применения. Действующее вещество - фенилпропаноламин гидрохлорид, вспомогательный компонент – сорбитол сироп.

Показания

Назначают исключительно собакам при недержании мочи, обусловленной функциональной недостаточностью сфинктера уретры.

Способ применения пропалина и дозы

Пропалин предназначен для применения внутрь. Препарат смешивают с кормом и задают в следующих дозах:

  • Собакам весом менее 25 кг по 3 капли (0,03 мл) на 4 кг массы собаки 2 раза в сутки, или 1 капля (0,01 мл) на 2 кг массы собаки 3 раза в сутки.
  • Собакам весом более 25 кг препарат задают по 0,75 мл на 25 кг массы собаки 2 раза в сутки, или 0,5 мл на 25 кг массы собаки 3 раза в сутки.

Длительность курса лечения – без ограничений.

Фармакологические свойства

Фенилпропаноламин гидрохлорид (действующее вещество пропалина) – синтетический симпатомиметик, который действует на альфа- и на бета-адренергические рецепторы (в меньшей степени) и кроме того опосредованно повышает высвобождение из депо норэпинефрина. Препарат обладает непосредственным действием на мускулатуру нижнего отдела мочевыводящих путей (усиливает сокращение и повышает тонус мочеполовой диафрагмы и сфинктера уретры). При оральном введении фенилпропаноламин быстро всасывается из желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Действующее вещество достигает максимальной концентрации в крови через 1 – 2 часа после употребления. Из организма выводится с мочой в неизменной форме или в форме неактивных метаболитов. Аккумуляции препарата не наблюдается.

Побочные действия

У чувствительных животных возможны аллергические реакции.

Противопоказания

Высокая чувствительность к отдельным компонентам лекарственного средства.

Запрещается использовать пропалин кормящим и щенным собакам.

Условия хранения

В сухом, защищенном от солнца месте, отдельно от кормов для животных и пищевых продуктов.

Срок годности – 2 года. Срок хранения после вскрытия – 3 месяца.

Температура хранения 15 – 25 ºС.

Производитель

Vetoquinol, Франция.


Propalin (Пропалин) by Vetoquinol - Сироп при недержании мочи у собак

Пропалин применяется для лечения мочеполовой системы у собак, а именно, при недержании мочи для повышения тонуса мочевого сфинктера. Препарат  выпущен в форме сиропа  для перорального применения. Пропалин применяют во время кормления, подмешивая препарат к корму.  В упаковке идет шприц для более точной дозировки. В качестве основного действующего вещества в 1мл. 5% раствора содержится 50 мг. фенилпропаноламина гидрохлорида, дополнительный компонент - сорбитол сироп.

Основное действующее вещество (фенилпропаноламин гидрохлорида) является синтетическим симпатомиметиком, который действует на альфа и бета адренергические рецепторы, а также повышает высвобождение из депо норэпинерфина. Непосредственно оказывает влияние на мускулатуру нижних отделов мочевыводящих путей. При оральном применении Пропалин быстро всасывается из желудочно- кишечного тракта. Из организма выводится с мочой в неизменной форме или в форме неактивных метоболитов.

 Пропалин назначается только собакам при недержании мочи, связанной с функциональной недостаточностью сфинктера уретры.

Дозировка препарата подбирается в зависимости от веса животного:
назначается по 3 капли на 4 кг  веса животного 2 раза в день или 1 капля на 2 кг  веса 3 раза вдень.
Собакам весом свыше 25 кг  рекомендованная доза составляет 0.5 мл на 25 кг веса 3 раза в день или 0.75 мл на 25 кг 2 раза в день.
Пропалин можно применять без ограничения.

 

Перед применением препарата проконсультируйтесь с ветеринаром и ознакомьтесь с ИНСТРУКЦИЕЙ, приведенной ниже!!!

 

Краткая ИНСТРУКЦИЯ к препарату.

Торговое наименование лекарственного препарата: Пропалин (Propalin). Международное непатентованное наименование: фенилпропаноламина гидрохлорид.

Лекарственная форма:

раствор для орального применения.

Действующие вещества:

фенилпропаноламина гидрохлорид - 50 мг/мл

Лекарственная форма и упаковка:

Раствор для перорального применения. Выпускается в герметично закрытых флаконах из ПЭТ объемом по 30 и 100 мл. В комплекте с дозатором вместимостью 1,5 мл.

Свойства:

Пропалин относится к синтетическим симпатомиметикам группы аминов.

Механизм действия:

Фенилпропаноламина гидрохлорид, входящий в состав лекарственного препарата, является синтетическим симпатомиметиком группы аминов. Он оказывает стимулирующее воздействие на α-адренергические рецепторы, повышая высвобождение норэпинефрина (норадреналина) из нервных окончаний, который воздействует непосредственно на гладкую мускулатуру нижнего отдела мочевыводящих путей, повышает тонус и усиливает сокращение сфинктера уретры. Фенилпропаноламина гидрохлорид быстро всасывается из желудочно-кишечного тракта, достигая максимальной концентрации в плазме крови спустя 1-2 часа после перорального применения и выводится из организма частично неизменным и в виде метаболитов через выделительную систему.
 

Показания:

Пропалин применяют для симптоматического лечения недержания мочи у собак при функциональной недостаточности сфинктера уретры.
 

Пособ применения и дозировка:

Пропалин применяют собакам перорально, ежедневно в суточной дозе 0,06 мл на 1 кг массы тела животного. Суточную дозу следует разделить на 2 или 3 приема.
 

Противопоказания:

• Не применять в комбинации с другими симпатомиметиками, антихолинергическими препаратами,
трициклическими антидепрессантами.
• Гиперчувствительность к компонентам лекарственного средства.
• Беременность и лактация.
 

Срок годности и условия хранения:

Хранить в закрытой упаковке производителя, отдельно от продуктов питания и кормов, в сухом, защищенном от прямых солнечных лучей, недоступном для детей и животных месте при температуре от 15 до 25°С. Срок годности лекарственного препарата при соблюдении условий хранения – 24 месяца со дня производства. Открытый флакон хранить не более 90 дней. Запрещается применять Пропалин по истечении срока годности.

Фасовка: 30 мл,  100 мл

Производитель: Vetoquinol, Vetoquinol S.A., Франция

Пропалин, 30 мл. МОЧЕПОЛОВАЯ СИСТЕМА. ВЕТПРЕПАРАТЫ. Ветеринарная аптека «ЗооФарм»

(Пропалиновый сироп)

СОСТАВ И ФОРМА ВЫПУСКА

В 1 мл 5% раствора для орального применения содержится в качестве действующего вещества 50 мг фенилпропаноламина гидрохлорида и вспомогательный компонент – сорбитол сироп. По внешнему виду представляет собой однородную бесцветную прозрачную суспензию. Расфасовывают в пластиковые флаконы по 30 мл и упаковывают по одному флакону в картонную коробку в комплекте со шприцем-дозатором.

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

Действующее вещество пропалина – фенилпропаноламин гидрохлорид – синтетический симпатомиметик – действует на альфа- и, в меньшей степени, на бета-адренергические рецепторы, а также опосредованно повышает высвобождение из депо норэпинефрина. Обладает непосредственным действием на мускулатуру нижнего отдела мочевыводящих путей (повышает тонус и усиливает сокращение сфинктера уретры и мочеполовой диафрагмы). При оральном введении фенилпропаноламин быстро всасывается из желудочно-кишечного тракта. Из организма выводится с мочой в неизменной форме или в форме неактивных метаболитов. Фенилпропаноламин гидрохлорид достигает пика концентрации в плазме крови через 1-2 часа. Аккумуляции лекарственного средства в период лечения не наблюдается.

ПОКАЗАНИЯ

Назначают только собакам при недержании мочи, обусловленной функциональной недостаточностью сфинктера уретры.

ДОЗЫ И СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ

Пропалин применяют внутрь в смеси с кормом во время кормления в дозе 3 капли на 4 кг веса животного 2 раза в день, или 1 капля на 2 кг веса животного 3 раза в день. Собакам массой тела 25 кг и больше пропалин задают в дозе 0,75 мл на 25 кг веса животного 2 раза в день, или 0,5 мл на 25 кг веса животного 3 раза в день. Продолжительность применения лекарственного средства – без ограничений.

ПОБОЧНЫЕ ДЕЙСТВИЯ

У гиперчувствительных животных возможны аллергические реакции. При правильном использовании и дозировке побочные явления не наблюдаются.

ПРОТИВОПОКАЗАНИЯ

Гиперчувствительность к компонентам препарата. Запрещается использовать пропалин щенным и лактирующим животным. Препарат не рекомендуется применять одновременно с другими симпатомиметиками, антихолинергическими препаратами и трициклическими антидепрессантами.

ОСОБЫЕ УКАЗАНИЯ

Особые меры предосторожности не предусмотрены.

УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ

Список Б. В сухом, защищенном от света, недоступном для детей и животных месте, отдельно от пищевых продуктов и кормов для животных при температуре 15-25 ºС. Срок годности – 24 месяца. Срок хранения после вскрытия флакона – 3 месяца.

Пропалин (Propalin) сироп для собак — Ipakitine

Описание

Препарат Propalin (Пропалин) для собак применяется с целью лечения недержания мочи из-за нарушений функций мочевого пузыря.

Дисфункция мочевыводящей системы у питомца может возникать по нескольким причинам: в результате возрастных изменений; ослабления сфинктера мочевого пузыря собаки; негативных последствий стерилизации животного; различных заболеваний и инфекций.

Проблема недержания мочи может исчезнуть после лечения инфекции или заболевания и дополнительного назначения Пропалина для собак не потребуется.

Дозировка препарата рассчитывается исходя из массы тела питомца, по одной из двух предлагаемых схем курсового лечения:

3 раза в сутки из расчета 2 капли на 1 кг массы тела собаки;

2 раза в сутки из расчета 3 капли на 1 кг массы тела собаки.

Для крупных собак, вес которых от 25 кг и выше, дозировка суспензии, в которой дается Пропалин, рассчитывается по схеме 3 раза в сутки из расчета 0,5 мл на 25 кг массы тела собаки или 2 раза в сутки из расчета 0,75 мл на 25 кг массы тела собаки.

Увеличение рекомендуемой нормы не способствует росту эффективности терапии. Дозировка препарата может быть уменьшена ветеринарным врачом после длительного периода лечения.

В соответствии с прилагаемой инструкцией, препарат следует предлагать питомцу, руководствуясь следующими правилами: лекарство необходимо давать собаке вместе с пищей, рекомендуется добавлять препарат непосредственно в еду.

Продолжительность курса терапии определяет ветеринарный врач индивидуально для каждого случая, в целом ограничений по длительности лечения нет.

Открытый препарат хранится в течение 3 месяцев в затемнённом месте, при температуре от +15 до +25˚С.

Важно помнить: назначать препарат Пропалин для собак, а также определять дозировку в каждом индивидуальном случае должен врач ветеринарной клиники. Этот же специалист обязательно предупредит о существующих противопоказаниях к применению Пропалина.

инструкция, теория и практика применения

Пропалин применяется в ветеринарии при недержании мочи у собак. Рассмотрим причины заболевания и породную предрасположенность к нему; принцип действия препарата, дозировку и противопоказания.

Недержание мочи

Недержание мочи у собак – один из самых распространённых симптомов в ветеринарной практике. Проявляется непроизвольным мочеиспусканием, постоянным выделением мочи во сне, капельным подтеканием. Возможно также во время прогулки, бурной радости, страха и т.

д.

Причины

Существует 2 группы причин недержания у собак: психологические, связанные с эмоциональными проблемами (врожденными или приобретенными), и нюансы физического здоровья. Разговор о психике у нас впереди, в этой статье krohotun.com не будет рассматривать этот пласт.

Физиологические причины же следующие:

  1. Врождённое смещение устьев мочеточников.
  2. Инфекции мочевыводящих путей.
  3. Недостаточность сфинктера мочевого пузыря.
  4. Новообразования мочевого пузыря.
  5. Неврологические нарушения.
  6. Смещение гормонального фона после стерилизации/кастрации.

Породная предрасположенность

У некоторых пород собак – боксёр, ротвейлер, доберман, бобтейл, ризеншнауцер, ирландский сеттер, веймаранер, спрингер спаниель – риск недержания мочи значительно повышается с возрастом и увеличением веса. Возможно, это связано с врождённой слабостью уретрального сфинктера.

У сук этих пород данная патология развивается после операции стерилизации с частотой до 60% случаев. Причина этого неясна, но, предположительно, недостаточность женских половых гормонов нарушает нормальный тонус мышц сфинктера уретры.

Полное излечение с восстановлением нормальной функции сфинктера невозможно. Лечение Пропалином только устраняет симптомы недержания мочи и является пожизненным.

Принцип действия

Основное действующее вещество Пропалина для собак – фенилпропаноламина гидрохлорид. Это симпатомиметик, оказывающий влияние непосредственно на адренорецепторы. Он способствует сокращению сфинктера уретры, расслабляя при этом гладкую мускулатуру мочевого пузыря.

Действующее вещество, входящее в состав препарата, не кумулируется в организме, выведение производится преимущественно с мочой. При длительном применении побочных симптомов не наблюдается.

Форма выпуска

Пропалин – сироп для перорального применения. Расфасовывается в пластиковые флаконы, содержащие по 30 или 100 мл лекарственного средства. На 1 мл сиропа приходится 50 мг действующего вещества. В комплекте прилагается шприц-дозатор.

На фото показаны 2 варианта фасовки пропалина: 100 и 30 мл.

Дозировка препарата

Препарат даётся во время еды. Можно подмешивать его к пище, а можно впрыскивать из шприца непосредственно в рот. Дозировка зависит от веса собаки.

При весе до 25 кг – сироп дают два раза в сутки по 3 капли на каждые 4 кг веса или три раза в сутки по 2 капли на каждые 4 кг веса.

При весе свыше 25 кг – два раза в сутки по 0,75 мл или три раза в сутки по 0,5 мл.

Противопоказания

Абсолютные противопоказания к применению Пропалина:

  • серьёзные заболевания сердца, сосудов и пищеварительного тракта;
  • инфаркт миокарда в анамнезе;
  • беременность;
  • пониженное артериальное давление;
  • органические повреждения сфинктера уретры.

Побочные действия

На начальном этапе лечения возможны побочные действия:

  • тошнота;
  • рвота;
  • запор;
  • сонливость;
  • психомоторное возбуждение;
  • аллергические реакции.

Снижение дозы препарата купирует все вышеуказанные явления.

Взаимодействие с другими препаратами

Не допускается одновременное применение Пропалина для собак с эритромицином и пероральными контрацептивами (Стоп-Интим, Контрасекс, Сексбарьер и др.).

Средства, угнетающие ЦНС (наркотические и ненаркотические анальгетики, седативные и наркотизирующие средства, снотворные и др.) на фоне лечения Пропалином, вызывают беспокойство и судороги.

Препарат несовместим с ингибиторами МАО (в том числе фуразолидоном).

Одновременный приём с сердечными гликозидами может спровоцировать аритмию.

Резерпин ослабляет лечебный эффект.

Отзывы

Рассмотрим эффективность лечения Пропалином на некоторых реальных примерах.

[q]Kria и Боксер Дора (г. Москва)

Суку боксёра стерилизовали три года назад. Недержание мочи началось буквально через пару месяцев. Врач прописал Пропалин. Недержание прекратилось практически сразу. Через два года лечение перестало помогать. Льётся сильно. Я увеличила дозу, но надолго это не помогает. Через месяц начинает сначала капать, а потом опять литься. В клинике прописали средство от цистита и увеличили дозу Пропалина в два раза. Уже год всё нормально.[/q]

[q]Анна и Бонд (г. Москва)

Доберман-девочка, 4 года. Год назад стерилизовали с удалением всех женских органов. До операции страдала от постоянных циститов и пиелонефрита. После стерилизации стала много есть, набрала вес. Прописали Пропалин пожизненно. Около месяца назад началось подтекание мочи во сне и обильное мочеиспускание днём. Добавили Дриптан и Прогинову, увеличили дозу Пропалина. Недержание прекратилось, дневной объём мочи значительно уменьшился.[/q]

[q]Tanuwa и цверг Бетси (г. Выборг)

Цвергшнауцер, 5 лет. Стерилизована три года назад, полгода назад начала подтекать моча. Врач посоветовал Пропалин для собак, но мы не можем нигде его найти. Остальные препараты не помогают. Может кто-нибудь поможет найти это лекарство?"

Лекарство хозяйке нашли на форуме. Последнее сообщение:

Спасибо! Найде значительно лучше! Дневное недержание исчезло полностью и ночное подтекание практически прекратилось тоже.[/q]

[q]Nata (г. Пермь)

Среднеазиатская овчарка, стерилизованная сука, 6 лет. В холодное время года просто катастрофа! Начинает страшно уписываться. Когда тепло проблем нет. Доктор рекомендовал ежегодные курсы Пропалина. Буквально сразу началось улучшение. Даём препарат уже третий год – проблема исчезла.[/q]

Пропалин – эффективное средство от недержания мочи, однако, в каждом конкретном случае назначать лечение и дозировку должен врач. Поскольку иногда требуется сочетанная терапия с гормональными и противовоспалительными средствами.

Аналоги и заменители

Действующее вещество Пропалина – фенилпропаноламин (норэфедрин) – относится к алкалоидам, является стереоизомером катина. Внесено в список "Перечня наркотических средств. .." и запрещено к продаже на территории РФ.

К сожалению, несмотря на всю эффективность данного средства зачастую приходится пользоваться его заменителями, в лучшем случае - аналогами.

Аналоги

Аналоги – препараты, действующим веществом в которых является фенилпропаноламин:

  • Тримекс – в 1 таблетке содержится 75 мг фенилпропаноламина гидрохлорида.
  • Диетрин – в 1 капсуле содержится 75 мг фенилпропаноламина гидрохлорида и 9 мг бензокаина.
  • Оринол – в 1 капсуле содержится 75 мг фенилпропаноламина гидрохлорида и 8 мг хлорфенирамина малеата.
  • Эффект – в 1 капсуле содержится 50 мг фенилпропаноламина гидрохлорида и 8 мг хлорфенирамина малеата.

Заменители

Заменители – препараты, применяющиеся для лечения недержания мочи, но имеющие отличный от Пропалина состав:

  • Дриптан – в 1 таблетке содержится оксибутина гидрохлорида 0,005 г. Обладает спазмолитическим и миотропным действием, расслабляет детрузор мочевого пузыря и увеличивает его вместимость, позволяя таким образом контролировать мочеотделение.
  • Прогинова – в 1 драже содержится 2 мг эстрадиола валерата. Это эстроген, устраняющий общие расстройства, вызванные недостаточной функцией половых желёз.

Пропалин для собак - Динозаврик


Описание

Пропалин 30 мл или 100 мл 5% для орального применения. Действующее вещество - фенилпропаноламин гидрохлорид, вспомогательный компонент – сорбитол сироп.
Показания

Назначают исключительно собакам при недержании мочи, обусловленной функциональной недостаточностью сфинктера уретры.
Способ применения пропалина и дозы

Пропалин предназначен для применения внутрь. Препарат смешивают с кормом и задают в следующих дозах:

    Собакам весом менее 25 кг по 3 капли (0,03 мл) на 4 кг массы собаки 2 раза в сутки, или 1 капля (0,01 мл) на 2 кг массы собаки 3 раза в сутки.
    Собакам весом более 25 кг препарат задают по 0,75 мл на 25 кг массы собаки 2 раза в сутки, или 0,5 мл на 25 кг массы собаки 3 раза в сутки.

Длительность курса лечения – без ограничений.


Фармакологические свойства

Фенилпропаноламин гидрохлорид (действующее вещество пропалина) – синтетический симпатомиметик, который действует на альфа- и на бета-адренергические рецепторы (в меньшей степени) и кроме того опосредованно повышает высвобождение из депо норэпинефрина. Препарат обладает непосредственным действием на мускулатуру нижнего отдела мочевыводящих путей (усиливает сокращение и повышает тонус мочеполовой диафрагмы и сфинктера уретры). При оральном введении фенилпропаноламин быстро всасывается из желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Действующее вещество достигает максимальной концентрации в крови через 1 – 2 часа после употребления. Из организма выводится с мочой в неизменной форме или в форме неактивных метаболитов. Аккумуляции препарата не наблюдается.
Побочные действия

У чувствительных животных возможны аллергические реакции.
Противопоказания

Высокая чувствительность к отдельным компонентам лекарственного средства.

Запрещается использовать пропалин кормящим и щенным собакам.
Условия хранения

В сухом, защищенном от солнца месте, отдельно от кормов для животных и пищевых продуктов.

Срок годности – 2 года. Срок хранения после вскрытия – 3 месяца.

Температура хранения 15 – 25 ºС.

С любовью и заботой о ваших питомцах!—
Сеть зоомагазинов Динозаврик 8(495) 544-5025
Интернет зоомагазин Динозаврик

http://www.dinozavrik.ru


Тел. 8(495) 544-5025 Доставка зоотоваров на Дом!

| Лидер Корм ​​для животных

ИНГРЕДИЕНТЫ : Переработанный животный белок, пшеница, кукуруза, животный жир, пшеничные отруби, сушеное мясо ягненка, рис, сушеная сахарная свекла, ароматизатор печени, соль, льняное семя, сухие пивные дрожжи.

МИНЕРАЛЫ: Кальций, фосфор, натрий, йод, цинк, медь, хлорид калия, железо, селен.

ВИТАМИНЫ: Вит. А, вит. Д, вит. Е, вит. С, вит. B1 - B2 - B3 (ниацин) - B6 - B12 - B7 (биотин) - B9 (фолиевая кислота), вит.K, холин, пантотенат кальция.

ПИТАТЕЛЬНЫЙ СОСТАВ ПИТАТЕЛЬНЫЕ ДОБАВКИ
Сырой белок  21% Витамин А (Е672)

15000 МЕ/кг

Сырой жир   11% Витамин D3 (E671)

 1000 МЕ/кг

Сырая зола  8% Витамин Е (3A700) 100 мг/кг
Сырая целлюлоза (волокно) 4% Витамин С (Stay C) 100 мг/кг

РУКОВОДСТВО ПО ЕЖЕДНЕВНОМУ КОРМЛЕНИЮ:

ВЕС СОБАКИ

1–5 кг

10–20 кг 30–40 кг 50–60 кг
ГР/ДЕНЬ 45 - 135 225 - 375 510 - 640 750 - 860

  

| Лидер Корм ​​для животных

ИНГРЕДИЕНТЫ:  Обработанный животный белок, пшеница, кукуруза, животный жир, пшеничные отруби, кукурузный глютен, сухая сахарная свекла, ароматизатор куриной печени, соль, льняное семя, сухие пивные дрожжи.

МИНЕРАЛЫ:  Кальций, хлорид калия, железо, селен.

ВИТАМИНЫ:  Вит. А, вит. Д, вит. Е, вит. С, вит. B1 - B2 - B3 (ниацин) - B6 - B12 - B7 (биотин) - B9 (фолиевая кислота), вит. K, холин, пантотенат кальция.

ПИТАТЕЛЬНЫЙ СОСТАВ ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ
Сырой белок 28% Витамин А (Е672)

18000 МЕ/кг

Сырой жир 16% Витамин D3 (E671)

 1500 МЕ/кг

Сырая целлюлоза (волокно) 3,5% Витамин Е (3A700) 150 мг/кг
Сырая зола 8% Витамин С 200 мг/кг

РУКОВОДСТВО ПО ЕЖЕДНЕВНОМУ КОРМЛЕНИЮ

ВЕС СОБАКИ 0,5 - 1 кг 2,5–3 кг 4–5 кг 6–7 кг 8–9 кг
ГР/ДЕНЬ 35 - 60 100 - 130 165 - 195 220 - 250 280 - 300

 

FLEA CONTROL 12 мл и 25 мл – суспензия для местного применения Для собак и кошек от 15 до 25 доз

Описание

Полное лечение: Убивает взрослых блох, яйца, личинки и прерывает полный жизненный цикл.

Выпускается во флаконах по 12 мл и 25 мл
12 мл =  Для собак и кошек весом менее 20 фунтов 15 доз
25 мл = Для собак весом более 11 фунтов от 10 до 25 доз

(дженерик, эквивалентный BAYER ADVANTAGE II – те же активные ингредиенты)
(суспензия для местного применения) только для наружного применения
Уничтожение: блох, яиц, личинок и вшей.

  • Один раз ежемесячно местно (SPOT-ON) аппликация защищает в течение 30 дней.
  • Убивает взрослых блох, яйца, личинки и прерывает их жизненный цикл.
  • Местное (Spot-ON) средство от блох для собак. Убивает блох в течение 12 часов.
  • Одна обработка предотвращает дальнейшее заражение блохами на месяц
  • Лечит, предотвращает и контролирует заражение вшами

Активный ингредиент:

  1. Имидаклоприд 9,1%
  2. Пирипоксифен 0,46%
  • Используйте шприц, чтобы отмерить необходимое количество в соответствии с весом вашего питомца, как указано в следующей дозировке:
  • ДОЗИРОВКА:
    Менее 10 фунтов = 0. 4 мл (маленькие собаки и кошки)
    Более 10 фунтов = 0,8 мл (крупные кошки)
    От 11 до 20 фунтов = 1 мл (средняя собака)
    От 21 до 55 фунтов = 2,5 мл (крупная собака)
    Более 55 фунтов = 4 мл (очень крупная собака)

ВАЖНО:
Эта суспензия для местного применения предназначена только для нанесения на кожу вашего питомца (местно). … PRO-LINE Topical Suspension — это препарат, который используется только на коже (местное применение) домашних животных для борьбы с блохами.

PRO-LINE (DL) по-прежнему содержит проверенный активный ингредиент имидаклоприд, обнаруженный в Advantage, который убивает 98-100% взрослых блох в течение 12 часов, останавливает укусы блох за 3-5 минут и убивает повторно заражающих блох в течение два часа.Результатом является быстрое облегчение от укусов взрослых особей, независимо от того, есть ли у вашей собаки блохи или она подцепила блох от другого животного.

Этот продукт выводит превосходную борьбу с блохами на новый уровень благодаря добавлению регулятора роста насекомых (IGR) пирипроксифена. PRO-LINE DL активно воздействует на ВЕСЬ жизненный цикл блох для эффективного лечения существующих блох и предотвращения заражения блохами.

Побочные эффекты:
Индивидуальная чувствительность, хотя и редко, может возникнуть после использования любого пестицида для домашних животных.Если признаки сохраняются или становятся более серьезными, немедленно обратитесь к ветеринару.

Важные меры предосторожности
Опасность для человека: Advantage вызывает раздражение глаз. Вред при проглатывании. Не допускать попадания в глаза или на одежду. Избегайте контакта с кожей. Тщательно вымойте руки с мылом и теплой водой после работы. Храните в недоступном для детей месте.

ОБЩАЯ ИНФОРМАЦИЯ:

В развитии блох выделяют четыре стадии: яйца и взрослые особи. Самцы и самки блох спариваются, и через два дня самка блохи начинает откладывать яйца.Яйца часто откладываются на животное, но, поскольку они не клейкие, выпадают во внешнюю среду. Наряду с яйцами самка блохи откладывает большое количество фекалий (часто называемых «блошиной грязью»). Грязь от блох растворяется в красном цвете при увлажнении; это потому, что это в первую очередь переваренная кровь. Блоха откладывает 30-50 яиц в день, как правило, группами от 3 до 15 штук. За всю жизнь (от нескольких месяцев до двух лет, в зависимости от вида) блоха может произвести от 400 до 1000 яиц. Через два дня (или больше, в зависимости от температуры) после откладывания яйца оно вылупляется, и личинка, похожая на крошечную личинку, начинает питаться фекалиями, оставленными ее матерью.Личинка проходит несколько фаз развития, занимающих в общей сложности около недели. В это время личинка начинает плести кокон и называется куколкой. Кокон липкий и часто покрывается мелкой грязью или песком, его можно найти глубоко в ковре или щелях. Через неделю куколка превращается во взрослую особь и выходит из кокона, когда чувствует вибрации, углекислый газ или тепло, что говорит ей о том, что животное-хозяин находится рядом. Весь жизненный цикл занимает около 15 дней, но куколка может оставаться в состоянии покоя в неблагоприятных условиях (например,г., простуда) и продлить цикл до года. Это важно помнить при планировании борьбы с блохами.

В развитии блох выделяют четыре стадии: яйца и взрослые особи. Самцы и самки блох спариваются, и через два дня самка блохи начинает откладывать яйца. Яйца часто откладываются на животное, но, поскольку они не клейкие, выпадают во внешнюю среду. Наряду с яйцами самка блохи откладывает большое количество фекалий (часто называемых «блошиной грязью»). Грязь от блох растворяется в красном цвете при увлажнении; это потому, что это в первую очередь переваренная кровь.Блоха откладывает 30-50 яиц в день, как правило, группами от 3 до 15 штук. За всю жизнь (от нескольких месяцев до двух лет, в зависимости от вида) блоха может произвести от 400 до 1000 яиц. Через два дня (или больше, в зависимости от температуры) после откладывания яйца оно вылупляется, и личинка, похожая на крошечную личинку, начинает питаться фекалиями, оставленными ее матерью. Личинка проходит несколько фаз развития, занимающих в общей сложности около недели. В это время личинка начинает плести кокон и называется куколкой.Кокон липкий и часто покрывается мелкой грязью или песком, его можно найти глубоко в ковре или щелях. Через неделю куколка превращается во взрослую особь и выходит из кокона, когда чувствует вибрации, углекислый газ или тепло, что говорит ей о том, что животное-хозяин находится рядом. Весь жизненный цикл занимает около 15 дней, но куколка может оставаться в состоянии покоя в неблагоприятных условиях (например, на холоде) и продлевать цикл до года. Это важно помнить при планировании борьбы с блохами.

Хранение и утилизация
Не загрязнять воду, продукты питания или корма при хранении или утилизации.Хранение: Хранить в прохладном, сухом месте. Беречь от замерзания. Утилизация пестицидов: надежно оберните исходный контейнер несколькими слоями газеты и выбросьте в мусорное ведро. Утилизация контейнера: Не используйте повторно пустой контейнер. Заверните контейнер и положите в таш.

Аминокислотный профиль сыворотки у 51 собаки с иммунодепрессивной энтеропатией (IRE): пилотное исследование клинических аспектов и исходов | BMC Veterinary Research

В медицине хорошо документирована роль АК при ВЗК и язвенном колите [4, 15, 16].При ВЗК человека целостность кишечного эпителиального барьера может быть нарушена воспалительным процессом, что вызывает проникновение возбудителя, симптомы недостаточности питания и общую депривацию аминокислот, что связано с депрессией и потерей мышечной массы [4, 16, 17, 18]. Модель язвенного колита (ЯК) на мышах показала снижение содержания нескольких аминокислот, таких как TYR, глутамин и аланин [19].

АК используются в качестве строительных блоков для синтеза макромолекул слизистой оболочки кишечника, а также играют важную роль во внутриклеточном белковом обмене и энергетических субстратах энтероцитов [3].Однако в ветеринарии редко изучают модификации АК у собак с хроническими энтеропатиями [5, 12, 13]. В нашем исследовании собаки, пораженные IRE, показали более низкую концентрацию TRP, PHE и TYR в сыворотке, чем здоровые собаки. Сообщалось об уменьшении TRP при IBD и PLE собак [5, 12, 13], но мы обнаружили, что PHE и TYR также снижены у собак с IRE, как и у людей.

Это конкретное состояние может снижать абсорбцию АК со снижением TRP, PHE и TYR [4]. Кроме того, у человека описано, что дисбактериоз может изменять концентрацию АК при ВЗК, снижая их всасывание [4, 19].Однако недостаточность PHE и TYR еще не была описана при IRE у собак, хотя может иметь место патогенный механизм, сходный с таковым в медицине человека. Собаки с PLE, вероятно, также имеют более высокую потребность в пищевом белке из-за повышенного спроса из-за продолжающегося воспаления [5]. Кроме того, собаки с ЭБЭ могут быть не в состоянии удовлетворить потребность в АК как из-за потери АК в кишечнике, так и из-за гипо/анорексии, которые характеризуют это конкретное заболевание [5]. Эта последняя гипотеза может объяснить, почему уровни PHE и TRP были ниже у наших собак с IRE, с или без PLE. Во многих исследованиях описывается, как интеграция TRP, PHE, HIS и глутамина в ВЗК человека является важной частью терапии [1, 18, 20, 21], предлагая добавки TRP в качестве вспомогательного средства для лечения ВЗК человека [1]. Фактически, у людей добавка TRP улучшает клинические признаки, массу тела и кишечную проницаемость и снижает провоспалительные цитокины [1, 4, 20].

В настоящее время только одно исследование ветеринарной медицины описывает использование L-аргинина и L-глутамата для улучшения двигательной функции желудка [21].Хотя эффекты интеграции АК у собак с ИРЭ еще не установлены, добавки могут оказывать благотворное клиническое воздействие на собак с ИРЭ, как и на людей с ВЗК.

У наших собак с IRE уровни ARG, LYS и PRO были выше, чем у здоровых собак. Ранее об этом не сообщалось в ветеринарии, но это было описано у людей. У людей ВЗК влияет на метаболизм АК, демонстрируя повышенные уровни изолейцина (и его первого продукта деградации 3-метил-2-оксовалерат), МЕТ, LYS, GLY, ARG и PRO и сниженные уровни VAL, TYR и SER по сравнению с контрольной группой [16, 19]. В частности, было показано, что MET, который также является предшественником гомоцистеина, повышен как в плазме, так и в слизистой оболочке толстой кишки у пациентов с ВЗК [19]. Тенденция к увеличению количества АК у пациентов с ВЗК может указывать на повышенный синтез АК de novo, возможно, из-за воспаления [22]. На самом деле известно, что воспалительные состояния стимулируют катаболизм белков и высвобождение АК из мышечной ткани, а повышенная концентрация АК может указывать на более высокий оборот АК [14, 19].

Кроме того, мы хотели оценить возможную взаимосвязь между АА и клиническими данными, общими белками, альбумином и клиническим течением наших собак IRE, поскольку эти данные отсутствуют в литературе по ветеринарной медицине.

Во-первых, хотя все собаки в группе IRE получали одинаковую диету, GLU, как правило, был ниже у собак с BCS 3/9. ГЛУ является предшественником синтеза глутатиона, и у детей с ВЗК уровни ГЛУ в моче значительно выше, чем у здоровых людей. Более высокая потеря GLU с мочой предполагает, что глутатион не может быть оптимально синтезирован и восполнен, но связь с BCS остается неясной [23]. Модификация сывороточных АК по отношению к СБК еще не анализировалась.Масса тела, телосложение, мышечная масса и распределение жира среди пород сильно различаются [24]. Эти различия потенциально могут вызывать изменения в метаболизме пищевых АК, а также в концентрации каждой АК [24]. Хотя на концентрацию АК может влиять диета и, возможно, время голодания [5], мы уменьшили обе эти ошибки, поскольку все собаки IRE получали одну и ту же гидролизованную диету и голодали в течение 8 часов перед забором крови.

В нашем исследовании HIS, PHE и TRP в сыворотке значительно снизились у собак с PLE по сравнению с собаками без PLE.Этот вывод подтверждает результаты Катрани [5], но, как показано в наших случаях ЭПБ, как ПНЕ, так и ГИЧ могут быть снижены. TRP у собак является аминокислотой, необходимой для диеты, важной для синтеза белка и предшественником кинуренина, серотонина, мелатонина и пиколиновой кислоты. В исследовании Катрани сообщалось об увеличении экспрессии кишечного фермента индоламина 2,3, диоксигеназы 1 (IDO-1) и катаболизма TRP у собак с ЭБЛ, что сходно с таковым у людей с ВЗК [5, 13, 25].

В медицине описано противовоспалительное действие HIS и PHE.Обе АК вызывают снижение уровней интерлейкинов 6, 8 и TNFα, и их уровни в сыворотке, по-видимому, снижены у человека с ВЗК и язвенным колитом. Противовоспалительные эффекты HIS и PHE зависят от их функции в плотных соединениях кишечника [4, 26].

У собак с PLE может возникнуть такое же патологическое состояние, как и у людей, определяющее снижение HIS и PHE. В нашем исследовании мы сравнивали PLE с собаками без PLE, в отличие от Kathrani et al. которые считали PLE против здоровых собак.Таким образом, различия в концентрации АК в сыворотке у собак с ЭЭ обусловлены разной популяцией в исследовании, поскольку мы сравнивали собак с НЭ с ЭЭ или без ЭЭ. Наши данные показывают, что у собак с PLE снижение HIS и PHE в сыворотке можно рассматривать в дополнение к снижению TRP.

Поскольку ЭБК считается более тяжелой формой воспаления кишечника [5], положительная корреляция между ГИС, ФГЭ и ТРП и концентрацией альбумина в сыворотке крови может рассматриваться как показатель тяжести потерь из желудочно-кишечного тракта [5].

При ВЗК человека HIS и PHE действуют как ранние маркеры воспаления кишечника [26] и показывают отрицательную корреляцию с показателями активности заболевания [2].

В нашем исследовании уровни АК в сыворотке не были связаны с оценочными категориями CCECAI при T0. В ветеринарных исследованиях Tamura et al. описали значительную отрицательную корреляцию между оценкой CCECAI и SER плазмы на момент постановки диагноза [12]. Кроме того, в другом исследовании были обнаружены положительные корреляции между показателями CCECAI и VAL в плазме, а также между показателями CCECAI и концентрациями ALA в плазме [14].Это не было неожиданностью, поскольку АК могут различаться в зависимости от того, измеряются ли они в сыворотке или плазме [19]. Это различие может быть связано с высвобождением медиаторов из тромбоцитов в процессе процессов свертывания крови. Недавнее исследование Yu et al. предполагает, что сыворотка может быть более чувствительна к обнаружению биомаркеров по сравнению с плазмой, тогда как измерение АК в плазме может быть более воспроизводимым [27].

До сих пор в ветеринарии не проводилось исследований концентрации АК в сыворотке и их связи с последующим наблюдением у собак с IRE.В нашем исследовании пациенты, не ответившие на лечение, показали более низкие концентрации TRP, PHE и HIS в сыворотке, чем пациенты, ответившие на лечение. Поскольку это первый отчет, в котором оценивалась концентрация АК в зависимости от ответа на лечение, прямое сравнение с ветеринарной литературой невозможно. Тем не менее, мы можем только догадываться об этих данных, так как на сегодняшний день АА все еще являются спорной темой для собак IRE. По нашему мнению, у собак, не ответивших на лечение, может быть снижено всасывание АК, особенно TRP, PHE и HIS, и, возможно, сопутствующий дисбактериоз, который может влиять на концентрацию этих конкретных АК в сыворотке крови.

Ограничения этого исследования включают разницу в количестве собак IRE и CD, а также то, что CD получали другую диету, что могло повлиять на результаты.

В медицине было показано, что диета может влиять на состав микробиоты и что интеграция аминокислот имеет положительный эффект [3]. Оценка состава микробиоты по отношению к концентрации АК в сыворотке также представляет интерес для ветеринарии.

Оценка АК в сыворотке не повторялась во время последующего наблюдения, хотя она может дать некоторую практическую информацию о необходимости или пользе их приема.Еще одним ограничением исследования является отсутствие оценки мышечного состояния. Этот параметр может привести к дальнейшим интересным выводам.

Статус аминокислот у собак с нефропатией с потерей белка — Калифорнийский университет в Дэвисе

@article{8ae0f687ef684bbeaf8c5d9a219a919a,

title = «Аминокислотный статус у собак с нефропатией с потерей белка»,

abstract = «in Background: Dogs with Proteuria in Background: заболевание почек может способствовать потере белково-энергетической траты и недоеданию.Мало что известно о статусе аминокислот (АК) у собак с нефропатией с потерей белка (PLN). Цели: Целью нашего исследования было дальнейшее выяснение статуса AA у PLN собак с гипотезой о том, что у PLN собак статус AA изменился бы по сравнению со здоровыми собаками. Животные. Тридцать собак PLN, принадлежащих клиентам, сравнивали с 10 здоровыми контрольными собаками. Методы: проспективное обсервационное исследование. В исследование были включены собаки с PLN, которые были доставлены в учебный госпиталь. Профили АА в плазме измеряли с использованием автоматизированного анализатора АА для высокоэффективной жидкостной хроматографии.Результаты: по сравнению с контрольными собаками у PLN-собак были значительно более низкие концентрации лейцина, треонина, гистидина, глицина, пролина, аспарагина, тирозина, о-гидроксипролина и серина, а также суммы как незаменимых, так и заменимых аминокислот (P <0,05). ). Собаки с PLN имели значительно более высокие отношения тирозина к фенилаланину и валина к глицину и значительно более низкое отношение глицина к серину (P <0,05). Выводы и клиническое значение. Собаки с PLN имеют измененный статус AA по сравнению со здоровыми собаками.Эти результаты могут иметь терапевтическое значение при определении оптимального ведения собак с PLN, например, предоставление добавок АК наряду с другим стандартным лечением. ",

ключевых слов = "эссенциальная, болезнь почек, неэссенциальная, протеинурия",

автор = "Паркер, { Валери Дж.} и Фашетти, {Андреа Дж.} и Кламер, {Бретт Г.}",

год = "2019",

месяц = ​​январь,

день = "1",

doi = "10.1111/ jvim.15436",

, язык = "Английский (США)",

, журнал = "Journal of Veterinary Internal Medicine",

, issn = "0891-6640",

, издатель = "Wiley-Blackwell",

}

Раствор на основе пролина поддерживает жизнеспособность и стволовые клетки собачьих жировых мезенхимальных стволовых клеток после гипотермического хранения

Abstract

Транспорт мезенхимальных стволовых клеток (МСК) в гипотермических условиях в 0.9% физиологический раствор (NSS) может увеличить гибель клеток и изменить стволовую структуру МСК. Настоящее исследование было направлено на оценку влияния раствора на основе пролина (PL-BS) на жизнеспособность клеток и стволовость вновь созданных собачьих жировых мезенхимальных стволовых клеток (cAD-MSC) в гипотермических условиях. Охарактеризованные cAD-MSC хранили в 1, 10 и 100 мМ PL-BS или NSS при 4°C в течение 6, 9 и 12 часов перед оценкой. Результаты показали, что хранение в 1 мМ PL-BS в течение 6 часов снижало клеточный апоптоз и способность к пролиферации, но улучшало жизнеспособность клеток и потенциал митохондриальной мембраны.cAD-MSC сохраняли высокую экспрессию CD44 и CD90, но имели низкую экспрессию CD34 и MHC класса II. Способность cAD-MSC к дифференцировке в три линии не зависела от хранения в 1 мМ PL-BS. Анализ экспрессии генов показал, что иммуномодулирующие гены, включая IDO, HGF, PGE-2 и IL-6, активировались в cAD-MSC, хранящихся в 1 мМ PL-BS. В заключение, PL-BS можно эффективно применять для хранения cAD-MSC в гипотермических условиях. Эти результаты обеспечивают новое решение для эффективного обращения с cAD-MSC, которое может быть многообещающим для клинического применения.

Образец цитирования: Horcharoensuk P, Yang-en S, Narkwichean A, Rungsiwiwut R (2022) Раствор на основе пролина поддерживает жизнеспособность и стволовость мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани собак, после гипотермического хранения. ПЛОС ОДИН 17(3): e0264773. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0264773

Редактор: Nazmul Haque, Университет MAHSA, Малайзия, МАЛАЙЗИЯ

Получено: 5 октября 2021 г.; Принято: 17 февраля 2022 г .; Опубликовано: 1 марта 2022 г.

Copyright: © 2022 Horcharoensuk et al.Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные содержатся в документе и в его вспомогательных информационных файлах.

Финансирование: Медицинский факультет Университета Шринахаринвирот (MED-GRAD-150; 511/2563 и MED-RES-200; 217/2563). Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) представляют собой мультипотентные клетки, способные регенерировать и дифференцироваться во многие типы клеток [1]. Терапевтический потенциал МСК, особенно в регенеративной медицине, широко известен благодаря их стволовой активности [2], в том числе способности мигрировать в поврежденные участки, иммуномодулирующим, противовоспалительным, антиапоптозным, неоангиогенезным, антимикробным действиям и регенерации тканей. .Недавно были проведены клинические испытания терапии МСК для лечения ряда заболеваний, таких как сердечно-сосудистые, неврологические, иммунно-опосредованные и связанные с травмами заболевания и так далее. Подавляющее большинство клинических испытаний находились на фазе 2 (61,0%), в то время как другие находились на фазах 1 (30,8%), 3 (7,5%) и 4 (0,7%) соответственно. Кроме того, эти испытания проводились в 51 стране мира, особенно в Китае (25,25%), Соединенных Штатах Америки (20,6%) и Испании (7,67%) [3]. Рабочий процесс, основанный на клеточной терапии, состоит из трех основных сложных процессов. Первый – это извлечение МСК из доноров; требуется, чтобы этот шаг выполнялся в центре обработки ячеек. Наиболее распространенными источниками МСК у взрослых людей являются костный мозг, жировая ткань и периферическая кровь соответственно [4]. Между тем, те, что у животных-компаньонов, включают жировую ткань и костный мозг. Кроме того, жировые ткани можно легко и практически получить от домашних собак и кошек с помощью обычной процедуры стерилизации [5].Во-вторых, необходимо, чтобы МСК были выделены, культивированы, размножены и сохранены в условиях замораживания для длительного хранения. В-третьих, перед трансплантацией клетки необходимо разморозить и затем культивировать. Наконец, собранные и обработанные клетки требуют транспортных растворов для транспортировки, прежде чем они будут применены к пациентам [6].

Время транспортировки пакетов стволовых клеток зависит от расстояния между центром обработки клеток и больницей. Как правило, при краткосрочной транспортировке требуется контроль температуры либо при сильном переохлаждении (2–8°C), либо при комнатной температуре (25°C).Наоборот, для длительной транспортировки требуется замороженное состояние (ниже 0°С), чтобы криопротектор работал, предотвращая гибель клеток [7, 8]. Ранее влияние температуры хранения на МСК широко изучалось. Гальвес-Мартин и его коллеги, изучавшие влияние температуры хранения на стволовые клетки, полученные из жировой ткани человека (hADSC), хранившиеся в различных растворах для хранения при 4°C, 25°C и 37°C в течение до 60 часов, продемонстрировали, что hADSC способны сохранять максимальную жизнеспособность при 4°C по сравнению с жизнеспособностью при 25°C и 37°C соответственно [9].Gniadek с коллегами продемонстрировали, что мононуклеарные клетки периферической крови (МНК), консервированные в 5% растворе сывороточного альбумина человека и Hypothermosol FRS, при 4°C обладают более высокой жизнеспособностью клеток, чем при 25°C [10]. Эти результаты подчеркивают важность подходящих растворов для поддержания жизнеспособности стволовых клеток при хранении при 4°C. Для кратковременного хранения и транспортировки клеток в качестве гипотермических растворов можно применять ряд растворов, таких как 0,9% физиологический раствор (NSS), раствор Рингера, Plasma-Lyte A, фосфатно-солевой буфер (PBS), тромбоцитарно-солевой раствор. богатая плазма и др.В клинических испытаниях на людях 0,9% NSS использовали для кратковременной транспортировки МСК человека [11]. Однако сообщалось о негативном влиянии NSS на жизнеспособность клеток и стволовость MSC. Например, Чен и его коллеги продемонстрировали, что хранение мезенхимальных стволовых клеток пуповины человека (hUC-MSC) в NSS при 4 ° C значительно снижает жизнеспособность клеток и способность к адгезии в зависимости от времени, но увеличивает время удвоения популяции. Можно предположить, что hUC-MSC не могут быть эффективно восстановлены после хранения в гипотермических условиях и могут потерять способность к пролиферации после трансплантации пациентам. Sohn и коллеги сообщили, что хранение стволовых клеток костного мозга человека (hBMSCs) в NSS при 4°C снижает их жизнеспособность, уровень колониеобразующих единиц и способность к дифференцировке в три линии. Это свидетельствует о том, что кратковременное сохранение МСК в НСС при 4°С может быть неэффективным методом, так как происходит снижение способности клеток к пролиферации и дифференцировке [12, 13].

Таким образом, целью настоящего исследования было повышение эффективности NSS в качестве решения для кратковременного хранения в гипотермических условиях собачьих жировых мезенхимальных стволовых клеток (cAD-MSC).На сегодняшний день не было сообщений об использовании пролина, нового криозащитного агента, в качестве добавки к растворам для транспортировки клеток. Таким образом, пролин был бы отличным кандидатом для изучения защитных эффектов в условиях гипотермии.

Материалы и методы

Использование для животных

Протоколы использования животных в настоящем исследовании были одобрены Институциональным комитетом по этике Университета Сринакхаринвирот (COA/AE-017-2563). Образцы подкожного или периовариального жира были собраны во время обычных процедур кастрации или овариогистерэктомии у трех собак в больнице для животных iVET.Критерии включения собак были следующими: (1) возраст от одного до трех лет, (2) полная вакцинация в соответствии с рекомендациями AAHA, (3) профилактика эктопаразитов за три месяца до операции и (4) нормальный профиль крови.

Экспериментальные конструкции

В настоящем исследовании образцы были полностью рандомизированы и разделены на две части: (1) выделение и характеристика cAD-MSC и (2) оценка влияния раствора на основе пролина (PL-BS) на жизнеспособность клеток, митохондриальный мембранный потенциал (ММП), способность к пролиферации, специфические поверхностные маркеры, трехлинейная дифференцировка и иммуномодулирующие свойства цАД-МСК после хранения в гипотермическом состоянии.

В первой части из жировых тканей собак выделяли cAD-MSC и оценивали их стволовость. Во второй части кАД-МСК были разделены на три группы: контроль без хранения, гипотермическое хранение в NSS и гипотермическое хранение в растворе на основе пролина (PL-BS). L-пролин (каталожный номер P0380, Sigma-Aldrich ® , США) готовили в NSS в концентрациях 1, 10 и 100 мМ. Собранные cAD-MSC в группах 2 и 3 хранили в концентрации 1×10 6 клеток на 1 мл раствора для хранения и выдерживали при 4°C в течение 6, 9 и 12 часов, чтобы имитировать условия гипотермической транспортировки.cAD-MSC, растущие при 37 ° C, 5% CO 2 , использовали в качестве контрольной группы без хранения.

Выделение и размножение собачьих мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани

Жировая ткань была выделена у двух кобелей и одной суки, помещена в стерильные контейнеры, заполненные стерильным NSS, и передана в лабораторию стволовых клеток в течение двух часов. Жировые ткани промывали 70% этанолом, а затем PBS. Сосуды были удалены, а ткани измельчены на мелкие кусочки (<1 мм.) перед расщеплением тканей проводили путем добавления 0,5 мг/мл коллагеназы типа IV в PBS (каталожный номер 17104019, Gibco, Thermo Fisher Scientific, США) и инкубации в течение 1 часа при 37°C, 5% CO 2 . После этого активность фермента нейтрализовали культуральной средой, содержащей 10 % эмбриональной бычьей сыворотки (FBS, каталожный номер S1810, Biowest, США). После этого клеточную суспензию фильтровали через клеточный фильтр 40 мкм (каталожный номер 93040, SPL Life Sciences, Южная Корея) и центрифугировали при 2300 об/мин в течение 5 минут.Наконец, супернатант удаляли, а клеточные осадки ресуспендировали в культуральной среде, состоящей из модификации МЕМ-альфа (номер по каталогу Sh40265.02, Hyclone, США), 10% FBS, 1% пенициллина/стрептомицина (номер по каталогу 03-031-1B, Biological Industries, Израиль) и 10 нг/мл основного рекомбинантного белка фактора роста фибробластов человека (FGF-2/bFGF, каталожный номер PHG0026, Invitrogen, США). Клеточную суспензию высевали на культуральный планшет и инкубировали при 37°C, 5% CO 2 , культуральную среду заменяли через день.Эти клетки были обозначены как пассаж 0 (P0). Процедуру размножения проводили, когда клетки достигали 80–90% слияния. Вкратце, культуральную среду удаляли, а прилипшие клетки промывали PBS для удаления оставшихся остатков. Диссоциацию клеток проводили с использованием 0,05% трипсина/ЭДТА (каталожный номер 03-051-5B, Biological Industries, Израиль) и инкубировали при 37°C, 5% CO 2 в течение 5 минут. После инкубации клетки осторожно диспергировали давлением из пипетки и нейтрализовали ферментативную активность добавлением культуральной среды, содержащей 10% FBS.Клеточную суспензию центрифугировали при 2300 об/мин в течение 5 минут, после чего супернатант удаляли, а клеточный осадок ресуспендировали в культуральной среде. В конце концов, клеточную суспензию высевали на культуральный планшет, и эти клетки обозначали как пассаж 1 (P1). Протокол размножения повторяли, чтобы умножить количество клеток. В экспериментах использовали клетки с 3 по 5 пассажи (П3-П5).

Анализ жизнеспособности клеток и апоптотических/некротических фракций

Как не хранящиеся, так и хранящиеся cAD-MSC оценивали на процентное содержание живых клеток и долю апоптотических/некротических клеток с использованием ApoScreen ® Annexin V Apoptosis Kit-FITC (номер по каталогу 10010–02, SouthernBiotech, США). Вкратце, клетки собирали, промывали PBS и ресуспендировали в буфере для связывания 1x. В клеточную суспензию добавляли антитело к аннексину V-FITC, затем инкубировали при 4°С в течение 15 минут; после этого добавляли йодид пропидия (PI). Живые и апоптотические/некротические клетки помещали в 1×10 4 клеток, а затем анализировали с помощью проточного цитометра Guava easyCyte 5HT (Millipore, США).

Анализ митохондриального мембранного потенциала

МСК cAD оценивали на ММП с использованием набора для анализа потенциала митохондриальной мембраны TMRE (каталожный номер ab113852, Abcam, Великобритания).Вкратце, 250 нМ TMRE добавляли в 1×10 5 клеток/лунку как нехранимых, так и хранимых cAD-MSC в суспензионном состоянии; клеточную суспензию инкубировали в течение 15 минут, а затем дважды промывали 0,2% BSA в PBS перед загрузкой в ​​96-луночный планшет и оценивали интенсивность флуоресценции с помощью микропланшет-ридера (Synergy HT, BIO-TEK, США) с Ex/ Em = 549/575 нм.

Анализ пролиферации

Не хранящиеся и хранящиеся cAD-MSC собирали, промывали и высевали обратно в 96-луночные планшеты в концентрации 1x10 4 клеток на лунку и инкубировали с 5% CO 2 при 37°C в течение 24 часа.Пролиферацию клеток оценивали с использованием набора для пролиферации клеток I (МТТ, каталожный номер 11465007001, Roche Diagnostics, Германия). Вкратце, 10 мкл раствора МТТ I добавляли в планшет для культивирования клеток и инкубировали в течение 4 часов. Поэтому в планшет для культивирования клеток добавляли 100 мкл раствора МТТ II и культивировали в течение 24 часов. Поглощение измеряли с помощью устройства для считывания микропланшетов (фотометр для микропланшетов HiPo MPP-96, Biosan, Латвия) при 550 нм.

Экспрессия специфических поверхностных антигенов

Анализ специфических поверхностных антигенов для МСК, включая CD44, CD90, CD34 и МНС класса II, был проведен методом проточной цитометрии.Вкратце, осадки клеток не хранящихся и хранящихся cAD-MSC промывали PBS и ресуспендировали в буфере холодного потока (PBS с 5% бычьим сывороточным альбумином (BSA), каталожный номер 03-010-1B, Biological Industries, Израиль) в концентрации 5×10 5 клеток/пробирку окрашивали конъюгированными антителами в течение 30 минут и хранили при 4°C с защитой от света. После инкубации клеточную суспензию однократно промывали буфером холодного течения и ресуспендировали с 400 мкл буфера холодного течения. Наконец, антигены клеточной поверхности вводили в 1×10 4 клеток и затем анализировали с помощью проточной цитометрии.Антитела, использованные в настоящем исследовании, представляли собой моноклональное антитело анти-CD44-FITC (каталожный номер 11-5440-42, Invitrogen, Thermo Scientific, США), анти-MHC класса II-FITC (каталожный номер 11-5909-42, Invitrogen). , анти-CD34-PE (каталожный номер MA1-81855, Invitrogen) и анти-CD90-PE (каталожный номер 12-5900-42, Invitrogen).

Анализ трехлинейной дифференцировки

И не хранящиеся, и хранящиеся cAD-MSC индуцировали для дифференцировки в три линии: адипогенные, хондрогенные и остеогенные, чтобы оценить потенциал дифференцировки.Адипогенная дифференцировка была адаптирована из предыдущих исследований [14, 15] и дополнена набором Chemicon ® Mesenchymal Adipogenesis Kit (каталожный номер SCR020, Sigma-Aldrich ® , США). Адипогенная индукционная среда состояла из DMEM с высоким содержанием глюкозы, 15% кроличьей сыворотки, 1 мкМ дексаметазона, 10 мкг/мл инсулина, 200 мкМ индометацина, 0,5 мМ изобутилметилксантина (IBMX) и 1% пенициллина/стрептомицина. Среду меняли каждые 1-2 дня. На 21-й день клетки фиксировали 4% параформальдегидом (PFA), промывали PBS и окрашивали раствором масляного красного O.Среду для дифференцировки ChondroMAX (каталожный номер SCM123, Sigma-Aldrich ® , США) использовали для хондрогенной дифференцировки. Среду для хондрогенной дифференцировки меняли каждые 1–2 дня. На 21-й день клетки фиксировали 4% PFA, окрашивали и промывали дистиллированной водой, содержащей раствор альцианового синего (каталожный номер B8438, Sigma-Aldrich ® , США). Набор для дифференцировки остеогенеза StemPro (каталожный номер A1007201, Gibco, США) использовали для остеогенной дифференцировки.Среду остеогенной дифференцировки меняли каждые 3–4 дня. На 21-й день клетки фиксировали 4% PFA, промывали дистиллированной водой и окрашивали раствором ализаринового красного S (каталожный номер А5533, Sigma-Aldrich ® , США).

Экспрессия иммуномодулирующего гена

Тотальную РНК экстрагировали из не хранящихся и хранящихся cAD-MSC с использованием набора для очистки РНК GeneJET (каталожный номер K0731, Thermo Scientific, США) и в соответствии с протоколом производителя. Концентрацию общей РНК определяли на спектрофотометре Nanodrop 2000c (Thermo Scientific, США).Тотальную РНК обратно транскрибировали для синтеза кДНК с использованием набора Superscript III Enzyme Reverse Transcriptase (каталожный номер 18080093, Invitrogen, Thermo Scientific, USA). Экспрессию генов оценивали с помощью количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР) с использованием термоциклера C1000 TouchTM и системы обнаружения ПЦР в реальном времени CFX96 (Bio-Rad, США). Реакции проводили с использованием iTaq Universal SYBR ® Green Supermix (каталожный номер 1725120, Bio-Rad, США) с иммуномодулирующими генами, включая индоламин 2, 3-диоксигеназу (IDO), фактор роста гепатоцитов (HGF), простагландин. E2 (PGE-2) и интерлейкин-6 (IL-6), а также представляющие интерес гены-мишени.Ген 18S, ген домашнего хозяйства, служил контролем. Последовательности праймеров, основанные на предыдущем исследовании, показаны в таблице S1. Условия реакции состояли из 40 циклов при температуре предварительной денатурации 95°С в течение 30 секунд, температуре денатурации 95°С в течение 5 секунд и температуре отжига/расширения 60°С в течение 30 секунд соответственно. Результаты экспрессии генов количественно оценивали путем нормализации с использованием метода 2 -ΔΔCT .

Статистический анализ

Эксперименты проводились трижды, и данные были представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (SD).Данные анализировали с помощью программы GraphPad Prism версии 9.2.0 (GraphPad Software, Inc., США). Различия между группами оценивали с помощью дисперсионного анализа (ANOVA). Последующие множественные сравнения были сделаны с помощью теста Тьюки-Крамера. Статистическая значимость была принята при значении p <0,05.

Результаты

Выделение и характеристика стволовых клеток, полученных из жировой ткани собак

Морфология.

После 2 дней изоляции чашки для культивирования состояли из нескольких прикрепленных клеток с различной морфологией, включая фибробластоподобные или эпителиоподобные формы.Через 7 дней клетки стали более гомогенными, а доминирующие клетки стали фибробластоподобными. Клетки достигали 80–90% слияния на 14-й день изоляции. Кроме того, морфология трех клеточных линий, выделенных от разных доноров, не отличалась заметно друг от друга (S1 Fig).

Экспрессия специфических поверхностных антигенов.

На основании проточной цитометрии выделенные клетки экспрессировали CD44 (97,10 ± 1,71%), CD90 (96,88 ± 0,50%), CD34 (2,28 ± 0,53%) и MHC класса II (1,24 ± 0,86%), как показано на рис. 1.Кроме того, заметной разницы в экспрессии специфических поверхностных антигенов не наблюдалось среди трех клеточных линий, выделенных от разных доноров (рис. S2).

Рис. 1. Экспрессия специфических поверхностных антигенов мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани собак, в различных условиях.

Хранящиеся cAD-MSC с высокой экспрессией CD44 и CD90, но лишенные CD34 и MHC класса II, что было похоже на контрольную группу.

https://doi.org/10.1371/журнал.pone.0264773.g001

Трилинейная дифференциация.

Выделенные клетки проявляли способность к дифференцировке, которую можно разделить на адипогенные, хондрогенные и остеогенные линии, как показано на рис. 2. В адипоцитах были видны окрашенные в красный цвет капли жира. Хондроциты представляли собой окрашенные в синий цвет сфероидальные клетки. Отложенные кальцием остеоциты окрашивались в красный цвет. Все три линии cAD-MSC проявляли потенциал остеогенной дифференцировки. Кроме того, различия между тремя линиями не были отчетливыми (S3 Fig).

Рис. 2. Влияние гипотермического раствора на трехлинейную дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани собак.

Хранящиеся cAD-MSC были способны дифференцироваться в адипоциты, хондроциты и остеоциты. Окрашенные в красный цвет капли жира в адипоцитах указывают на потенциал адипогенной дифференцировки. Синий цвет указывает на то, что хондроциты способны продуцировать протеогликан во внеклеточном матриксе. Остеоциты, накопившие кальций, показаны красным цветом.Шкала баров = 300 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0264773.g002

Влияние раствора на основе пролина (PL-BS) на жизнеспособность клеток, способность к пролиферации, потенциал митохондриальной мембраны (ММП) и стволовость цАД-МСК после хранения в гипотермическом состоянии

1 мМ PL-BS снижал гибель клеток при гипотермическом хранении.

Согласно результатам проточной цитометрии, поддержание cAD-MSC в гипотермических условиях резко увеличивало уровни апоптотических и некротических клеток в зависимости от времени (рис. 3А и рис. S4).Однако хранение cAD-MSC в 1 мМ PL-BS в течение 6 часов значительно улучшало жизнеспособность клеток за счет ингибирования раннего апоптоза и некроза по сравнению с другими концентрациями как PL-BS, так и NSS, как показано на рис. 3A и 3B. Примечательно, что только через 6 часов после хранения количество живых клеток в 1 мМ PL-BS (90,71±1,20%) было значительно выше, чем в NSS (77,19±2,19%, p<0,01). Кроме того, клетки в 1 мМ PL-BS (1,43±1,10%) имели значительно меньшее количество ранних апоптотических клеток, чем клетки в NSS (9.91±4,97%, p<0,05), как показано на рис. 3C.

Рис. 3. Влияние гипотермического раствора на жизнеспособность клеток и фракцию апоптоза/некроза.

(A) cAD-MSC хранили в гипотермических растворах в концентрациях 1, 10 и 100 мМ PL-BS или NSS до 6, 9 и 12 часов. (B) Через 6 часов гипотермического хранения процент cAD-MSC, выживших в 1 мМ PL-BS, был значительно выше, чем в NSS (p<0,01). (C) Уровень ранних апоптотических клеток через 6 часов гипотермического хранения в 1 мМ PL-BS был значительно ниже, чем в NSS (p<0.05). Символы примечания: Звездочка означает, что значения значительно отличались от группы NSS; * = р<0,05 и ** = р<0,01. Строчные буквы a, b, c и d над чертой указывают на значительное отличие от контрольной группы; а = р<0,05, б = р<0,01, в = р<0,001 и г = р<0,0001.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0264773.g003

1 мМ PL-BS сохранял ММР при гипотермическом хранении.

Значения ММР были измерены с помощью спектрофотометра и показаны на рис. 4А.Через 6 часов хранения cAD-MSC, хранящиеся в NSS (7236,25 ± 552,61 а. - хранящиеся клетки. Однако ММП cAD-MSC, хранящихся в 1 мМ PL-BS, была значительно выше, чем у cAD-MSC, хранящихся в NSS (p<0,05).

Рис. 4. Сравнение потенциала митохондриальной мембраны и пролиферации мезенхимальных стволовых клеток собачьей жировой ткани в различных условиях.

(A) На основании анализа TMRE митохондриальный мембранный потенциал (MMP) cAD-MSC, хранившихся как в NSS, так и в 1 мМ PL-BS в течение 6 часов, был значительно ниже, чем в контрольной группе (p<0.0001 и р<0,001 соответственно). Однако ММП кАД-МСК, хранящихся в 1 мМ PL-BS, была значительно выше, чем в NSS (p<0,05). (B) Согласно анализу MTT, скорость пролиферации cAD-MSC, хранящихся в NSS или 1 мМ PL-BS, была значительно ниже, чем в клетках без хранения (p<0,01 и p<0,001 соответственно). символы примечания; Звездочка представляет значительную разницу (p<0,05). Строчные буквы b, c и d указывают на значительное отличие от контрольной группы; б = р<0.01, с = р<0,001 и d = р<0,0001.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0264773.g004

Гипотермическое хранение снижает способность к пролиферации мезенхимальных стволовых клеток собачьей жировой ткани.

Анализ МТТ выявил скорость пролиферации прикрепившихся клеток, как показано на рис. 4В. Через 6 часов гипотермического хранения cAD-МСК, хранящиеся в NSS (0,3170 ± 0,0095 а. 0.4616±0,0505 а.е., р<0,01). Кроме того, не наблюдалось существенной разницы в скорости пролиферации между хранением в NSS и хранением в 1 мМ PL-BS.

Гипотермические условия не оказывали негативного влияния на экспрессию специфических поверхностных антигенов.

Анализ с использованием проточной цитометрии показал, что не было очевидной разницы в экспрессии CD44, CD90, CD34 и MHC класса II между контролем и клетками, хранящимися в NSS и 1 мМ PL-BS (рис. 1 и S2).

Гипотермические растворы не изменяли потенциал дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани собак.

После фиксации и окрашивания дифференцированных клеток специфическими красителями cAD-MSC, хранившиеся в NSS или 1 мМ PL-BS, сохраняли свою способность к дифференцировке в три линии, как показано на рис. 2. Способность к дифференцировке была подтверждена положительным окрашиванием масляным красным O, альциановый синий и ализариновый красный S для адипогенной, хондрогенной и остеогенной дифференцировки соответственно. Кроме того, не было очевидной разницы в способности к дифференцировке между линиями cAD-MSC, полученными от разных доноров (рис. S3).

Гипотермические растворы повлияли на экспрессию иммуномодулирующих генов в собачьих жировых мезенхимальных стволовых клетках.

Анализ экспрессии генов с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени показал, что экспрессия IDO и IL-6 была значительно повышена в МСК cAD, хранящихся в NSS и 1 мМ PL-BS, по сравнению с МСК cAD без хранения ( p<0,001), как показано на рис. 5 и в таблице S2. Уровень экспрессии HGF в cAD-MSC, хранящихся в 1 мМ PL-BS, был значительно выше, чем у cAD-MSC, хранящихся в NSS и не хранящихся клетках (p<0,0.05). Кроме того, уровень экспрессии PGE-2 из cAD-MSC, хранящихся в 1 мМ PL-BS, был ниже, чем у cAD-MSC, хранящихся в NSS (p<0,05).

Рис. 5. Влияние гипотермического раствора на экспрессию иммуномодулирующих генов.

На основании RT-PCR в реальном времени уровень экспрессии IDO и IL-6 значительно повышался, когда cAD-MSC хранились в NSS или 1 мМ PL-BS (p<0,001). Уровень экспрессии HGF значительно увеличился в cAD-MSC, хранящихся в 1 мМ PL-BS, по сравнению с не хранящимися клетками (p<0,0.05). Уровень экспрессии PGE-2 в сохраненных NSS-cAD-MSC был значительно выше, чем в не хранящихся клетках (p<0,05). символы примечания; IDO = индоламин 2, 3-диоксигеназа, IL-6 = интерлейкин-6, HGF = фактор роста гепатоцитов и PGE-2 = простагландин E2; Строчные буквы над столбцами указывают на значительную разницу по сравнению с контрольной группой; а = р<0,05, в = р<0,001 и г = р<0,0001.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0264773.g005

Обсуждение

Терапия мезенхимальными стволовыми клетками перспективна для пациентов, страдающих рядом заболеваний, таких как дегенеративные, иммуноопосредованные и метаболические заболевания [16].Минимальные критерии характеристик МСК, предложенные Международным обществом клеточной и генной терапии (ISCT), включают (1) прилипание к планшетам для культивирования клеток, (2) экспрессию специфических поверхностных антигенов, таких как CD73, CD90 и CD105, выше 95%. но экспрессия других, таких как CD34, CD45 или HLA-II, ниже 2%, и (3) дифференцировка на три линии: адипогенную, хондрогенную и остеогенную [17]. В ветеринарии одним из распространенных источников образования МСК у собак (Canidae) являются жировые ткани.Поэтому кАД-МСК широко изучались как в фундаментальных, так и в клинических исследованиях [5]. В настоящем исследовании недавно полученные cAD-MSC демонстрировали фибробластоподобную форму, способность к адгезии к культуральной пластине и трехлинейную дифференцировку, которые были сходны с характеристиками человеческих MSC [14, 15, 18]. Кроме того, cAD-МСК в нашем исследовании имели экспрессию CD44 и CD90 более 95%, но были лишены экспрессии CD34 и MHC класса II, как и в ряде предыдущих сообщений [19–21].

Согласно рекомендациям Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (US FDA), жизнеспособность продуктов стволовых клеток до клинического применения должна быть выше 70% [22].Интересно, что примерно в 70% клинических испытаний стволовых клеток использовали NSS, который одобрен FDA США в качестве решения для транспорта клеток [11, 23]. Общепризнано и доказано, что длительное хранение МСК при 4°С или при физиологической температуре провоцирует повреждение и гибель клеток. Было проведено несколько исследований МСК человека, и были получены противоречивые результаты. Например, Пал и его коллеги продемонстрировали, что, хотя хранение человеческих СККМ в NSS при 4°C не изменяет их способность к дифференцировке, клетки следует использовать в течение 6 часов, чтобы избежать гибели клеток [24]. Chen и коллеги предположили, что hUC-MSC могут храниться в NSS при 4°C до 6 часов без изменения экспрессии поверхностных антигенов, способности к дифференцировке и иммуномодулирующих свойств клеток. Однако последствиями могут быть негативные эффекты, такие как снижение клеточной пролиферации и способности к адгезии [12]. Напротив, исследование Зона и его коллег показало, что NSS влияет на способность к дифференцировке и колониеобразующие единицы hBMSCs в зависимости от времени [13].Тем не менее, эффект NSS может варьироваться в зависимости от источника МСК. Результаты Нофианти и его коллег показали, что hADSC могут поддерживать жизнеспособность клеток более 70% после хранения в NSS до 48 часов; однако скорость их пролиферации значительно снизилась после хранения в течение 24 часов. Авторы также предложили использовать hADSC для клеточной терапии в течение 24 часов [25]. Ра и его коллеги сообщили, что hADSC могут храниться в NSS до 72 часов без изменений поверхностных маркерных антигенов [26]. К сожалению, результаты Wu и его коллег показали, что hADSC не могут поддерживать жизнеспособность клеток выше 70% в NSS при 4°C [27]. Хотя многие исследования показали, что хранение клеток в NSS при 4°C снижает жизнеспособность клеток в зависимости от времени и варьирует в зависимости от источника клеток, информация о собачьих МСК все еще отсутствует. Таким образом, NSS был выбран в качестве основного решения для работы с cAD-MSC во время хранения в гипотермических условиях в настоящем исследовании. Настоящее исследование подтвердило, что NSS эффективно поддерживает жизнеспособность cAD-MSC при 4°C в течение 6–9 часов.Когда в NSS добавляли 1 мМ пролина, скорость раннего апоптоза цАД-МСК снижалась. Это привело к улучшению жизнеспособности cAD-MSC. Защитное действие пролина на ранний апоптоз и жизнеспособность клеток отчетливо наблюдалось после хранения цАД-МСК при 4°С в течение 6 часов. Из этих результатов можно сделать вывод, что 1 мМ пролина улучшает способность NSS обрабатывать cAD-MSC в гипотермических условиях. Более того, этот раствор не влиял на экспрессию специфических поверхностных антигенов и потенциал трехлинейной дифференцировки cAD-MSC.Однако способность к пролиферации сохраненных клеток не улучшалась ни при NSS [12, 25], ни при добавлении 1 мМ пролина, как показано в настоящем исследовании.

После пребывания в гипотермических условиях клетки адаптируются, снижая скорость метаболизма из-за снижения продукции АТФ, потребности в кислороде и деградации запасов энергии [28, 29]. Набухание клеток может происходить из-за задержки воды в результате потери K + и диффузии в клетки Na + и Cl - [30].Кроме того, это набухание может прогрессировать, когда клетки хранятся в растворе с большим количеством Na + и Cl -. Кроме того, длительное время хранения может снижать потенциал митохондриальной мембраны, что вызывает митохондриальную деполяризацию, способствуя митохондриальной дисфункции и, как следствие, прогрессирующей продукции АФК или окислительному стрессу, что в конечном итоге приводит к гибели клеток [31-33].

Криопротекторы играют решающую роль в защите клеток от замораживания (ниже 0°C).Кроме того, они также могут защитить клетки от низких температур (4°C) во время транспортировки клеток. Пролин использовали в качестве криозащитного агента для ооцитов [34], эритроцитов человека [35] и МСК человека [36]. Пролин представляет собой природное нетоксичное аминокислотное соединение [37]. Он был идентифицирован как проникающий криопротектор и действует как осмопротектор, помогая сбалансировать осмотическое давление между клетками и окружающей водой во время температурного стресса или солевого стресса от Na + , K + и Cl - [38].Кроме того, пролин стабилизирует белок и макромолекулы, такие как нуклеиновая кислота, при холодовом стрессе [35, 39, 40]. Более того, пролин действует как поглотитель АФК при длительном хранении [41]. В клетках метаболизм пролина помогает увеличить выработку глутатиона и поддерживать надлежащий уровень НАДФ + /НАДФН, что способствует энергетическому гомеостазу [39]. Из результатов настоящего исследования можно сделать вывод, что пролин может поддерживать целостность митохондрий во время экологического стресса и впоследствии ингибировать гибель клеток [42].

Несмотря на поддерживающее поддержание жизнеспособности cAD-MSC, PL-BS улучшили иммуномодуляцию cAD-MSC. Настоящее исследование показало, что гены, кодирующие IDO и IL-6, значительно активировались в cAD-MSC, хранящихся в PL-BS. В норме IDO экспрессируется во время иммуносупрессивных процессов посредством ингибирования провоспалительных Т-клеток, а также индукции популяции регуляторных Т-клеток [43]. IL-6 представляет собой про- и противовоспалительный цитокин, который играет важную роль в пролиферации МСК и иммуносупрессивной способности hBMSCs [44, 45].Более того, IL-6 поддерживает стволовость hBMSCs посредством ERK1/2-зависимых механизмов [46]. Таким образом, иммуносупрессивное действие цАД-МСК может быть улучшено за счет использования PL-BS во время гипотермической транспортировки. Настоящее исследование показало, что, несмотря на повышенную регуляцию генов IDO и IL-6, уровень экспрессии HGF все еще повышался после хранения cAD-MSC в PL-BS. Было продемонстрировано, что HGF уменьшает воспалительные клетки Th2 через дендритные клетки и стимулирует регуляторные Т-клетки к выработке иммуносупрессивных цитокинов, которые полезны при лечении аутоиммунных заболеваний [47].Кроме того, усиление экспрессии HGF в cAD-MSCs в настоящем исследовании может положительно коррелировать с улучшением жизнеспособности клеток, поскольку HGF играет жизненно важную роль в замедлении старения, повышении потенциала остеогенной дифференцировки и сохранении митохондриальной функции [48]. PGE-2 регулирует макрофаги и дендритные клетки, а также Т- и В-клетки; впоследствии это включает про- и противовоспалительные процессы [49]. Кроме того, ПГЕ-2 способствует миграции МСК [50] и подавлению ПГЕ-2, что приводит к снижению иммуномодулирующих свойств [51].В настоящем исследовании хранение cAD-MSC в PL-BS немного повышало экспрессию PGE-2, но это повышение было не таким высоким, как у cAD-MSC, хранящихся в NSS. Это может быть связано с наличием механизмов отрицательной обратной связи запасающих клеток для уменьшения избыточного количества пролина за счет снижения продукции PGE-2 [52, 53]. Таким образом, иммуномодулирующая способность кАД-МСК может быть улучшена за счет добавления TNF-α или IFN-γ во время культивирования [54, 55].

Выводы

Раствор на основе пролина оказывал кратковременное защитное действие на МСК cAD, хранившихся в гипотермических условиях.Добавление пролина в NSS снижало уровни ранних апоптотических клеток, возможно, за счет сохранения митохондриальной функции, вместе с улучшением жизнеспособности клеток и стволовостью cAD-MSC. Таким образом, раствор на основе пролина может применяться для кратковременной гипотермической транспортировки и может быть полезен в клинической практике.

Вспомогательная информация

S1 Рис. Морфология изолированных мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани собак.

Через 2 дня изоляции в культуральных чашках наблюдались прилипшие клетки различной морфологии, в том числе фибробластоподобной или эпителиоподобной формы.Через 7 дней клетки стали более гомогенными, а клетки фибробластоподобной формы стали доминирующими. Клетки достигли 80–90% слияния на 14-й день изоляции. Не было заметной разницы в морфологии клеток среди трех клеточных линий, выделенных от разных доноров. Все рисунки выполнены при 10-кратном увеличении. Шкала баров = 300 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0264773.s001

(TIF)

S2 Рис. Экспрессию специфических поверхностных антигенов недепонированных и депонированных собачьих жировых мезенхимальных стволовых клеток анализировали с помощью проточного цитометра.

Клетки, хранящиеся в NSS и 1 мМ PL-BS, в высокой степени экспрессировали как CD44, так и CD90, но были лишены как CD34, так и MHC класса II. Эти результаты не отличались от результатов контрольной группы.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0264773.s002

(TIF)

S3 Рис. Влияние гипотермического раствора на трехлинейную дифференциацию.

МСК cAD-MSC после хранения продемонстрировали дифференцируемость в три линии, включая адипоциты, хондроциты и остеоциты. Капли жира в адипоцитах окрашиваются в красный цвет, что указывает на потенциал адипогенной дифференцировки. Синий цвет указывает на то, что хондроциты способны продуцировать протеогликан во внеклеточном матриксе. Остеоциты с накоплением кальция показаны красным цветом. Шкала баров = 300 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0264773.s003

(TIF)

S4 Рис. Влияние гипотермического раствора на жизнеспособность клеток и апоптозную/некротическую фракцию.

МСК cAD от двух других доноров снижали количество живых клеток в зависимости от времени во время гипотермических условий.Однако хранение cAD-MSC в 1 мМ PL-BS в течение 6 часов значительно улучшало жизнеспособность клеток за счет уменьшения раннего апоптоза и некроза по сравнению с хранением в других концентрациях как PL-BS, так и NSS.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0264773.s004

(TIF)

S2 Таблица. Влияние гипотермического раствора на экспрессию иммуномодулирующих генов.

Результаты экспрессии генов были количественно определены путем нормализации с использованием метода 2 -ΔΔCT и показаны как значения Log 2 относительной экспрессии генов.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0264773.s006

(DOCX)

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить ветеринара и персонал больницы для животных iVET за предоставление всех образцов для настоящего исследования.

Каталожные номера

  1. 1. Шьям Х., Сингх С.К., Кант Р., Саксена С.К. Мезенхимальные стволовые клетки в регенеративной медицине: новая парадигма дегенеративных заболеваний костей. Реген Мед. 2017; 12(2): 111–114. пмид:28244826
  2. 2.Альфаро М.П., ​​Сарасвати С., Янг П.П. Молекулярные медиаторы биологии мезенхимальных стволовых клеток. Витам Горм. 2011 г.; 87: 39–59. пмид:22127236
  3. 3. Родригес-Фуэнтес Д.Е., Фернандес-Гарса Л.Е., Самия-Меса Х.А., Баррера-Баррера С.А., Каплан А. И., Баррера-Салданья Х.А. Текущее клиническое применение мезенхимальных стволовых клеток: систематический обзор. Арх Мед Рез. 2021; 52(1): 93–101. пмид:32977984
  4. 4. Хасс Р., Каспер С., Бём С., Джейкобс Р. Различные популяции и источники мезенхимальных стволовых клеток человека (МСК): сравнение МСК, полученных из тканей взрослых и новорожденных.Сигнал сотовой связи. 2011 г.; 9: 12. пмид:21569606
  5. 5. Вога М., Адамик Н., Венгуст М., Майдич Г. Стволовые клетки в ветеринарии – текущее состояние и варианты лечения. Передняя ветеринарная наука. 2020; 7: 278. pmid:32656249
  6. 6. Свиокло С., Коннон С.Дж. Краткосрочное хранение клеток для применения в клеточной терапии. Коннон CJ, редактор. Биотехнология для клеточной терапии. Уайли; 2017. С. 187–210.
  7. 7. Аояма Т. Транспортировка мезенхимальных стволовых клеток для клинического применения.Фам ПК, редактор. Мезенхимальные стволовые клетки — выделение, характеристика и применение. ИнтехОткрытый; 2017. С. 279–290.
  8. 8. Zhang F, Ren H, Shao X, Zhuang C, Chen Y, Qi N. Среда для хранения, продолжительность и концентрация клеток при кратковременном хранении влияют на ключевые характеристики мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани человека, для терапевтического применения. Пир Дж. 2017; 5: е3301. пмид:28533959
  9. 9. Гальвес-Мартин П., Хмадча А., Сориа Б., Кальпена-Кампмани А.С., Кларес-Наверос Б.Изучение стабильности упаковки и условий хранения мезенхимальных стволовых клеток человека для внутриартериального клинического применения у больных с критической ишемией нижних конечностей. Евр Джей Фарм Биофарм. 2014; 86(3): 459–468. пмид:24240028
  10. 10. Гнядек Т.Дж., Гаррицен Х.С.П., Стронецк Д., Щепиорковски З.М., МакКенна Д.Х.; Сотрудничество в области биомедицинского совершенства для более безопасного переливания крови (BEST). Оптимальные условия хранения для исследования афереза ​​(OSCAR): биомедицинское превосходство для более безопасного переливания (BEST) Совместное исследование. Переливание. 2018; 58(2): 461–469. пмид:29210068
  11. 11. Ścieżyńska A, Soszyńska M, Szpak P, Krześniak N, Malejczyk J, Kalaszczyńska I. Влияние гипотермических жидкостей для хранения на стабильность мезенхимальных стволовых клеток: всесторонний обзор и личный опыт. Клетки. 2021; 10(5): 1043. pmid:33925059
  12. 12. Chen Y, Yu B, Xue G, Zhao J, Li RK, Liu Z и др. Влияние растворов для хранения на жизнеспособность мезенхимальных стволовых клеток пуповины человека для трансплантации.Трансплантация клеток. 2013; 22(6): 1075–1086. пмид:23043973
  13. 13. Sohn HS, Heo JS, Kim HS, Choi Y, Kim HO. Продолжительность хранения in vitro влияет на ключевые характеристики стволовых клеток мезенхимальных стромальных клеток, полученных из костного мозга человека, для клинической трансплантации. Цитотерапия. 2013; 15(4): 460–466. пмид:23318345
  14. 14. Рассел К.А., Чоу Н.Х., Дукофф Д., Гибсон Т.В., Ламарр Дж., Беттс Д.Х. и другие. Характеристика и иммуномодулирующие эффекты мезенхимальных стромальных клеток, полученных из жировой ткани и костного мозга собак. ПЛОС Один. 2016; 11(12): e0167442. пмид:27
  15. 1
  16. 15. Neupane M, Chang CC, Kiupel M, Yuzbasiyan-Gurkan V. Выделение и характеристика собачьих жировых мезенхимальных стволовых клеток. Tissue Eng Часть A. 2008; 14(6): 1007–1015. пмид:19230125
  17. 16. Саиди П., Халабиан Р., Имани Фулади А.А. Показательный обзор терапии мезенхимальными стволовыми клетками, клинических перспектив и стратегий модификации. Исследование стволовых клеток. 2019; 6: 34. пмид:31620481
  18. 17.Доминичи М., Ле Блан К., Мюллер И., Слапер-Кортенбах И., Марини Ф., Краузе Д. и др. Минимальные критерии для определения мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток. Заявление Международного общества клеточной терапии. Цитотерапия. 2006 г.; 8(4): 315–317. пмид:16923606
  19. 18. Takemitsu H, Zhao D, Yamamoto I, Harada Y, Michishita M, Arai T. Сравнение мезенхимальных стволовых клеток собак, полученных из костного мозга и жировой ткани. BMC Vet Res. 2012 г.; 8: 150. pmid:22937862
  20. 19.Вога М., Ковач В., Майдич Г. Сравнение собачьих и кошачьих мезенхимальных стволовых клеток/лекарственных сигнальных клеток, полученных из жировой ткани, с учетом экспрессии маркеров клеточной поверхности, жизнеспособности, пролиферации и потенциала дифференцировки. Передняя ветеринарная наука. 2021; 7: 610240. pmid:33521084
  21. 20. Крешич Н., Шимич И., Лойкич И., Бедекович Т. Изменения транскриптома мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани собак: шаг к стандартизации терапии. Стволовые клетки2017; 2017: 4176292. pmid:28246532
  22. 21. Скревен Р., Кеньон Э., Майерс М.Дж., Янси Х.Ф., Скаско М., Боксер Л. и др. Иммунофенотип и профиль экспрессии генов мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани и костного мозга собак. Вет Иммунол Иммунопатол. 2014; 161 (1–2): 21–31. пмид:25026887
  23. 22. Бауэр СР. Продукты на основе стволовых клеток в медицине: нормативные требования FDA. Справочник по стволовым клеткам. 2004: 805–814.
  24. 23. Блумберг Н., Чолетт Дж. М., Пьетропаоли А. П., Фиппс Р., Спинелли С. Л., Итон М. П. и др.0,9% NaCl (обычный физиологический раствор) — может, все-таки не так уж и нормально? Transfus Apher Sci. 2018; 57(1): 127–131. пмид:29523397
  25. 24. Пал Р., Ханвате М., Тоти С.М. Влияние времени выдержки, температуры и различных растворов для парентерального введения на жизнеспособность и функциональность взрослых мезенхимальных стволовых клеток, полученных из костного мозга, перед трансплантацией. J Tissue Eng Regen Med. 2008 г.; 2(7): 436–444. пмид:18720444
  26. 25. Нофианти К.Э., Сари И.Н., Марлина Новиальди, Павитан Дж.А. Раствор для временного хранения мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани.Исследование стволовых клеток. 2018; 5: 19. пмид:30050919
  27. 26. Ra JC, Shin IS, Kim SH, Kang SK, Kang BC, Lee HY и др. Безопасность внутривенного вливания мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани человека, у животных и человека. Стволовые клетки Dev. 2011 г.; 20 (8): 1297–1308. пмид:21303266
  28. 27. Wu YD, Li M, Liao X, Li SH, Yan JX, Fan L и другие. Влияние культуральной среды, температуры и продолжительности хранения на жизнеспособность стволовых клеток, полученных из жировой ткани человека, для клинического использования.Мол Мед Респ. 2019; 19(3): 2189–2201. пмид:30664198
  29. 28. Hendriks KDW, Brüggenwirth IMA, Maassen H, Gerding A, Bakker B, Porte RJ и др. Снижение почечной температуры прогрессивно благоприятствует продукции митохондриальных АФК по сравнению с дыханием при сохранении гипотермической почки. J Transl Med. 2019; 17(1): 265. pmid:31409351
  30. 29. Коррейя С., Кошкин А., Каридо М., Эспинья Н., Шарич Т., Лима П.А. и др. Эффективное гипотермическое хранение кардиомиоцитов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека, совместимое с глобальным распространением клеток для клинического применения и токсикологических испытаний.Стволовые клетки Transl Med. 2016; 5(5): 658–669. пмид:27025693
  31. 30. Фуллер Б.Дж., Петренко А.Ю., Родригес Ю.В., Сомов А.Ю., Балабан К.Л., Гвиберт Э.Е. Биоконсервация гепатоцитов: современные представления о гипотермической консервации, криоконсервации и витрификации. Крио письма. 2013; 34(4): 432–452. пмид:23995411
  32. 31. Sun W, Wang Z, Cao J, Cui H, Ma Z. Холодовой стресс увеличивает образование активных форм кислорода посредством активации TRPA1 в клетках A549. Шапероны клеточного стресса.2016; 21(2): 367–372. пмид:26634370
  33. 32. Салахудин А.К., Хуан Х., Джоши М., Мур Н.А., Дженкинс Дж.К. Участие митохондриального пути в хранении на холоде и апоптозе, связанном с нагреванием, клеток проксимальных канальцев почек человека. Ам Джей Трансплант. 2003 г.; 3(3): 273–280. пмид:12614281
  34. 33. Ou J, Ball JM, Luan Y, Zhao T, Miyagishima KJ, Xu Y и др. ИПСК из гибернатора обеспечивают платформу для изучения адаптации к холоду и ее потенциального медицинского применения. Клетка. 2018; 173(4): 851–863.e16. пмид:29576452
  35. 34. Zhang L, Xue X, Yan J, Yan LY, Jin XH, Zhu XH и другие. L-пролин: высокоэффективный криопротектор для витрификации ооцитов мышей. Научный представитель 2016 г.; 6: 26326. pmid:27412080
  36. 35. Dou M, Lu C, Sun Z, Rao W. Комбинации природных криопротекторов L-пролина и трегалозы для криоконсервации эритроцитов. Криобиология. 2019; 91: 23–29. пмид:31693877
  37. 36. Фраймарк Д., Зель С., Вебер С., Худель К., Чермак П., Хофманн Н. и др.Систематическая оптимизация параметров протокола криоконсервации без использования Me(2)SO и сыворотки для мезенхимальных стволовых клеток человека. Криобиология. 2011 г.; 63(2): 67–75. пмид:21620818
  38. 37. Бхаттачарья С. Криопректанты и их использование в процессе криоконсервации. Бозкурт Ю., редактор. Биотехнология криоконсервации в биомедицинских и биологических науках. ИнтехОткрытый; 2018. С. 7–19.
  39. 38. Чонка ЛН. Физиологические и генетические реакции бактерий на осмотический стресс.Microbiol Rev. 1989; 53(1): 121–147. пмид: 2651863
  40. 39. Лян Х, Чжан Л, Натараджан С.К., Беккер Д.Ф. Пролиновые механизмы выживания при стрессе. Антиоксидный окислительно-восстановительный сигнал. 2013; 19(9): 998–1011. пмид:23581681
  41. 40. Сэмюэл Д., Кумар Т.К., Ганеш Г., Джаяраман Г., Ян П.В., Чанг М.М. и др. Пролин ингибирует агрегацию во время рефолдинга белка. Белковая наука. 2000 г.; 9(2): 344–352. пмид:10716186
  42. 41. Каул С, Шарма С.С., Мехта И.К. Способность L-пролина поглощать свободные радикалы: данные анализов in vitro.Аминокислоты. 2008 г.; 34(2): 315–320. пмид:17086481
  43. 42. Хейдари Р., Мохаммади Х., Ганбаринежад В., Ахмади А., Оммати М.М., Никнахад Х. и др. Добавка пролина смягчает раннюю стадию повреждения печени у крыс с перевязанными желчными протоками. J Basic Clin Physiol Pharmacol. 2018; 30(1): 91–101. пмид:30205645
  44. 43. Мбонге Дж. К., Николас Д. А., Торрез Т. В., Ким Н. С., Фирек А. Ф., Лэнгридж В. Х. Роль индоламин-2,3-диоксигеназы в подавлении иммунитета и аутоиммунитете.Вакцины (Базель). 2015 г.; 3(3): 703–729. пмид:26378585
  45. 44. Дорронсоро А., Ланг В., Феррин И., Фернандес-Руэда Дж., Забалета Л., Перес-Руис Э. и др. Внутриклеточная роль IL-6 в иммуносупрессии и пролиферации мезенхимальных стромальных клеток. Научный представитель 2020; 10(1): 21853. pmid:33318571
  46. 45. Bouffi C, Bony C, Courties G, Jorgensen C, Noël D. Зависимая от IL-6 секреция PGE2 мезенхимальными стволовыми клетками ингибирует локальное воспаление при экспериментальном артрите. ПЛОС Один.2010 г.; 5(12): e14247. пмид:21151872
  47. 46. Прикола К.Л., Кун Н.З., Халим-Смит Х., Сонг Ю., Туан Р.С. Интерлейкин-6 поддерживает стволовость мезенхимальных стволовых клеток костного мозга с помощью ERK1/2-зависимого механизма. Джей Селл Биохим. 2009 г.; 108(3): 577–588. пмид:19650110
  48. 47. Маральди Т., Беретти Ф., Гуида М., Заватти М., Де Пол А. Роль фактора роста гепатоцитов в иммуномодулирующем потенциале стволовых клеток амниотической жидкости. Стволовые клетки Transl Med. 2015 г.; 4(6): 539–547.пмид:25873747
  49. 48. Cao Z, Xie Y, Yu L, Li Y, Wang Y. Фактор роста гепатоцитов (HGF) и фактор стволовых клеток (SCF) поддерживали стволовость мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека (hBMSCs) во время долгосрочной экспансии за счет сохранения митохондриальной функции. через сигнальные пути PI3K/AKT, ERK1/2 и STAT3. Стволовые клетки Res Ther. 2020; 11(1): 329. pmid:32736659
  50. 49. Риччиотти Э., Фитцджеральд Г.А. Простагландины и воспаление. Артериосклеры Тромб Васк Биол.2011 г.; 31(5): 986–1000. пмид: 21508345
  51. 50. Lu X, Han J, Xu X, Xu J, Liu L, Huang Y и др. PGE2 способствует миграции мезенхимальных стволовых клеток посредством активации путей FAK и ERK1/2. Стволовые клетки 2017; 2017: 8178643. pmid:28740516
  52. 51. Lee BC, Kim HS, Shin TH, Kang I, Lee JY, Kim JJ и др. PGE2 поддерживает самообновление взрослых стволовых клеток человека посредством EP2-опосредованной аутокринной передачи сигналов, и его продукция регулируется межклеточным контактом.Научный представитель 2016 г.; 6: 26298. pmid:27230257
  53. 52. Goldstein RH, Sakowski S, Meeker D, Franzblau C, Polgar P. Влияние простагландина E2 (PGE2) на поглощение аминокислот и образование белка фибробластами легких. Дж. Биол. Хим. 1986 год; 261 (19): 8734–8737. пмид:3459727
  54. 53. Ardaillou N, Nivez MP, Bellon G, Combe C, Ardaillou R. Влияние простагландина E2 на поглощение пролина и синтез белка культивируемыми мезангиальными клетками человека. почки инт. 1990 г.; 38(6): 1151–1158.пмид:1963649
  55. 54. Yang HM, Song WJ, Li Q, Kim SY, Kim HJ, Ryu MO и др. Мезенхимальные стволовые клетки собак, обработанные TNF-α и IFN-γ, усиливают противовоспалительное действие через путь ЦОГ-2/PGE2. рез. вет. 2018; 119: 19–26. пмид: 29783120
  56. 55. Лин Т., Паджаринен Дж., Набесима А., Лу Л., Натан К., Ямсен Э. и др. Прекондиционирование мышиных мезенхимальных стволовых клеток синергетически усиливало иммуномодуляцию и остеогенез. Стволовые клетки Res Ther. 2017; 8(1): 277.пмид: 29212557

Агентство по охране окружающей среды США, Пестициды, Этикетка, SERGEANT'S FIPRONIL SQUEEZE-ON FOR DOGS, 03.02.2011

%PDF-1.6 % 72 0 объект > эндообъект 69 0 объект >поток 2011-02-23T08:55:06ZKofax Standard Multi-Page TIFF Storage Filter v3.03.0002011-03-28T11:21:19-04:002011-03-28T11:21:19-04:00Adobe Acrobat 9.43 Paper Capture Plug-in2 /3/2011 Этикетка пестицида, SERGEANT'S FIPRONIL SQUEEZE-ON FOR DOGS, SERGEANT'S PET CARE PRODUCTS, INC., 0251700136application/pdf

  • Агентство по охране окружающей среды США, Управление программ по пестицидам
  • Агентство по охране окружающей среды США, Пестициды, Этикетка, SERGEANT'S FIPRONIL SQUEEZE-ON FOR DOGS, 03. 02.2011
  • Этикетка продукта пестицида, SERGEANT'S FIPRONIL SQUEEZE-ON ДЛЯ СОБАК
  • uuid: 15613e8a-f784-437b-b767-64bf2ab15f40uuid: dc27f5e0-3abb-412c-b608-b5b53334febf конечный поток эндообъект 68 0 объект > эндообъект 73 0 объект >/ProcSet[/PDF/Text/ImageB]/XObject>>>/Повернуть 0/Тип/Страница>> эндообъект 1 0 объект >/ProcSet[/PDF/Text/ImageB]/XObject>>>/Повернуть 0/Тип/Страница>> эндообъект 4 0 объект >/ProcSet[/PDF/Text/ImageB]/XObject>>>/Повернуть 0/Тип/Страница>> эндообъект 8 0 объект >/ProcSet[/PDF/Text/ImageB]/XObject>>>/Повернуть 0/Тип/Страница>> эндообъект 12 0 объект >/ProcSet[/PDF/Text/ImageB]/XObject>>>/Повернуть 0/Тип/Страница>> эндообъект 15 0 объект >/ProcSet[/PDF/Text/ImageB]/XObject>>>/Повернуть 0/Тип/Страница>> эндообъект 19 0 объект >/ProcSet[/PDF/Text/ImageB]/XObject>>>/Повернуть 0/Тип/Страница>> эндообъект 23 0 объект >/ProcSet[/PDF/Text/ImageB]/XObject>>>/Повернуть 0/Тип/Страница>> эндообъект 27 0 объект >/ProcSet[/PDF/Text/ImageB]/XObject>>>/Повернуть 0/Тип/Страница>> эндообъект 28 0 объект >поток HWkO#[email protected]ˆ[email protected]\u>=Db$KZaOi$?_-'K\w_'&W?Y~[qI

    .

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.