Перейти к содержимому

Хорек кашляет после прививки: Признаки того, что хорек заболел Москва

Содержание

Признаки того, что хорек заболел Москва

Для того, чтобы понять, какие признаки больного хорька, давайте разберемся, как долен выглядеть здоровый хорек. Прежде всего, это холодный и влажный нос (как у собак), живой взгляд ясными глазами, блестящая красивая шерсть, хороший аппетит. Животное должно быть в меру упитанное, но не толстое, ребра должны прощупываться, но не слишком. Язык и десна должны быть здорового цвета, то есть розового. Неприятного запаха ощущаться не должно.

Признаки того, что Ваш зверек заболел

Температура тела

Нормальная температура тела хорька – в среднем должны быть 38,8 °С. Если у животного наблюдается повышенная температура, это может быть первым сигналом таких заболеваний, как грипп или чумке. Убедиться, что температура действительно повышенная, Вы можете по сухому и горячему носу.

Кашель

Хозяева хорьков наверняка замечали, как животное кашляет. Обычно такое бывает, когда хорек подавится едой. Если же Вы наблюдаете кашель на протяжении достаточно длительного времени, который сопровождается слезоточивостью и насморком, это может свидетельствовать о наличии инфекционного заболевания.

Стул

Понос, который продолжается несколько дней, может указывать на обезвоживание организма, что несет серьезную угрозу жизни зверька. Если же стул питомца черного цвета, это может быть признаком язвы желудка.

Сильный зуд

Этим милым животным свойственно сильное расчесывание. Очень часто это наблюдается после сна. Но также это может быть признаком наличия блох, микоза или сухости кожи.

Обмороки и приступы слабости

Поведение хорька также может о многом сказать о его самочувствии. Обмороки могут быть при пониженном уровне содержания глюкозы в крови, а также при высокой температуре, боли или сердечно-сосудистых заболеваниях. В этом случае Вам срочно нужно обратиться к ветеринару, так как данные симптомы могут повлечь за собой серьезные последствия.

Затрудненное мочеиспускание

Если Вы наблюдаете, что у зверька проблемы с мочеиспусканием, или же он оставляет небольшие следы мочи, возможно, у него желчекаменная болезнь. При этом животное может сильно кричать.

В этом случае хорька стоит немедленно показать ветеринару, так как причин болезненного мочеиспускания может быть огромное количество.

Повышенное слюноотделение

Часто это сигнализирует о наличии инородного тела во рту. Но также это может быть громким сигналом владельцам о том, что у зверька пониженное содержание глюкозы в крови.

Если Вы заметили, что Ваш хорек начал вести себя не так как всегда, у него замедлилась реакция, ухудшился аппетит, Вам следует немедленно показать его ветеринару, так как последствия могут быть самыми разнообразными.

 

На консультацию мы можете записаться и прийти лично к нам или вызвать ветеринара на дом!

 +7 (499) 394-10-48   

  +7 (926) 736-11-78

 

Также Вам может быть полезна такая информация:

Заблуждения о содержании хорька

Уход за шерстью хорька

Линька у хорька


Болезни (заболевания) домашних хорьков - симптомы, диагностика, лечение

Содержание
  1. Симптомы заболеваний у хорька
  2. Болезни кожи
  3. Заболевания пищеварительной системы
  4. Заболевания сердечно-сосудистой и дыхательной систем
  5. Заболевания мочеполовой системы
  6. Заболевания нервной системы и опорно-двигательного аппарата

Домашние хорьки в той или иной степени подвержены различным заболеваниям инфекционного и неинфекционного характера. Задача владельца – своевременно распознать признаки начавшейся болезни у своего питомца и обратиться к ветеринарному врачу для диагностики и лечения.


В самом начале мы поговорим об общих симптомах, которые будут свидетельствовать о признаках боли у хорька и начавшейся болезни. Сразу следует обращать внимание на изменения в поведении хорька – спокойный по поведению питомец может начать выражать агрессию по отношению к владельцам или, напротив, проявлять признаки отстраненности – зарываться в одежду, искать укрытие. Снижение массы тела также может сигнализировать о заболевании: сопровождать этот признак могут отсутствие аппетита или полный отказ от корма. Кроме того, следует обращать внимание на изменение походки, уменьшение игривости. Больной хорек перестает ухаживать за собой, вокализирует при попытках его переместить, игнорирует любимые игрушки. Появление одного или нескольких указанных выше признаков – повод обратиться к врачу.

Болезни кожи у хорьков могут спровоцировать различные возбудители – клещи, вши и блохи, грибковые и эндопаразитарные болезни, а также болезни эндокринологического характера. Внешнее их проявление – появление алопеций (залысин), корочек, язв и расчесов на теле животного. Поведение хорька может изменяться (питомец вокализирует, беспокоится, расчесывает поверхность тела) или оставаться статичным. Важный момент – своевременная диагностика причины болезни. Врач соберет анамнез и проведет осмотр. Для постановки диагноза берутся различные материалы (соскобы, отпечатки, образцы корочек и шерсти) для отправки в лабораторию и проводится дополнительная диагностика, например, ультразвуковое исследование.

Заболевания пищеварительной системы – довольно обширная группа болезней хорьков, различных по этиологии и лечению. Владельцу следует контролировать вес питомца, следить за изменениями пищевого поведения (отказ от пищи, снижение аппетита), появлением рвоты, отмечать характер стула (размягчение, изменение цвета или же диарея), а также его длительное отсутствие. Симптомы, говорящие о том, что ваш питомец в большой опасности – обезвоживание (собранная складка на холке медленно или вовсе не расправляется), кровотечения из естественных отверстий, потеря веса и боли в области живота. Диагностика данной группы заболеваний обширная, зависит от анамнеза, клинической картины. Дополнительная диагностика строится на симптомах болезни – взятие анализов крови на общие исследования и обнаружения инфекций, смывов, истечений; требуется проведение УЗ-исследования или рентгенографии, не исключена также возможность проведения лапароскопии – диагностической операции для установления окончательного диагноза.

Заболевания сердечно-сосудистой и дыхательной систем. Данная группы заболеваний объединена, так как существуют признаки, единые для заболеваний обеих систем. Так, истечения из носа, одышка при вдохе, казалось бы, характерные для заболеваний верхних дыхательных путей, могут свидетельствовать и о сердечной недостаточности. При явлениях одышки, хрипов, истечений из носа, кашля и рвотных позывов, аномалиям поведения – сонливости или апатии, отсутствии аппетита — следует обратиться к врачу. Диагностика данных групп заболеваний может включать в себя рентгенографию, ЭХО, взятие смывов и других анализов.

Заболевания мочеполовой системы довольно часто встречаются у хорьков. По своему происхождению их можно отнести к дегенеративным, инфекционным, метаболическим, алиментарным, анатомическим, токсическим, а также связанным с появлением новообразований. Следует обращать внимание на изменение цвета и объема мочи, отсутствие актов мочеиспускания или наоборот их учащению; изменения внешнего состояния половых органов – припухлость, появление истечений. Изменение состояния самки после родов может свидетельствовать о неудачно прошедших родах. К группе риска по данной группе заболевания находятся кастрированные хорьки.

Заболевания нервной системы и опорно-двигательного аппарата –довольно обширная группа, которая может быть связана с неонатологическими проблемами, новообразованиями, инфекционными заболеваниями. Если у вашего питомца изменилась походка, появился наклон головы, появились аномалии поведения, опора на конечности отсутствует или неполная, появились судороги, признаки боли – следует обратиться к врачу. Диагностика может разниться от проведения стандартного неврологического осмотра и визуальной диагностики до проведения магнитно-резонансной или компьютерной томографии.

Как видите, список симптомов довольно велик и временами может свидетельствовать о заболевании различных этиологий или одновременно нескольких групп. Самый оптимальный вариант профилактики заболевания – своевременная дегельментизация, вакцинация и ежегодная диспансеризация. Не следует пренебрегать также и правильным составлением рациона, организацией условий содержания, для чего владелец должен обладать базовой информацией об особенностях физиологии и потребностях домашних хорьков.

Статья подготовлена врачами отделения экзотических животных «МЕДВЕТ»
© 2018 СВЦ «МЕДВЕТ»

Вакцинация собак - Ветеринарные клиники Доктор Вет

С помощью вакцинации вы защитите своего питомца от основных распространённых и тяжёлых в лечении болезней, сведёте к минимуму риск преждевременной гибели.

Привитое животное, как правило, либо не подвергается заболеваниям, к которым выработался иммунитет, либо переболевает ими в лёгкой форме.

Оптимальный возраст для начала вакцинации – два месяца. Если вакцинация не проведена в срок, щенок может переносить заболевание очень тяжело. Возможен смертельный исход.

Основы вакцинации для собак и хорьков.

  1. Нобивак Паппи DP. Эта вакцина не является обязательной, но позволяет обезопасить малыша. Её можно вводить щенкам с четырех-шестинедельного возраста. Вакцина содержит в своём составе готовые антитела и вводится животным, которых очень рано отняли от матери, либо в случае, если в доме живёт несколько взрослых животных, способных принести с улицы вирус.
  2. Основная противовирусная вакцинация.
    Первый этап. С двухмесячного возраста вводят поливалентные вакцины. Как правило, они позволяют организму сформировать иммунитет от основных вирусных инфекций собак (чума, гепатит, парвовирусная инфекция, парагрипп) и бактериального заболевания – лептоспироз. В клиниках “Доктор Вет” мы используем вакцины Нобивак DHPPi + Нобивак Lepto (Голландия), Мультикан-4 (РФ), Мультикан-6 (РФ), Мультикан-8 (РФ) и др.
    Второй этап. Проводится с теми же вакцинами с интервалом 21-28 дней. Затем вакцина Нобивак вводится повторно раз в год, а различные виды Мультикана – в возрасте 10-12 месяцев и далее раз в год.
  3. Прививка против бешенства. Наиболее опасное заболевание, так как может передаваться человеку и приводить к гибели.
    Вакцинация в “Доктор Вет” проводится вакциной Нобивак Rabies. Она вводится не ранее трехмесячного возраста и вводится раз в год, хотя, согласно инструкции производителя, иммунитет может сохраняться до 3 лет.
    Напоминаем, что в связи с высокой опасностью болезни, в ветеринарном законодательстве РБ указано, что вакцинация против бешенства должна проводиться ежегодно. При несоблюдении данных рекомендаций возможна административная ответственность в виде наложения штрафа государственными инстанциями.
  4. Прививка от дерматомикозов (вакцинация от лишая). Используются российские вакцины Поливак и Вакдерм-F. Применяются для профилактики и лечения грибковых заболеваний. Прививка вводится с профилактической целью дважды с интервалом 14 дней. Иммунитет вырабатывается на год после второго введения. Вакцину вводят трижды с интервалом 14 дней. Но поскольку развитие заболевания напрямую связано с иммунной системой организма, вакцина при низком иммунном статусе может оказаться неэффективна, поэтому чаще всего такие вакцинации проводятся выставочным животным по требованию клубов.

Записаться на приём

Прививки в основном делают не ранее 2 месячного возраста.
До двухмесячного возраста животное находится рядом с мамой, получает полезные для организма вещества и антитела к различным заболеваниям с её молоком. Собственная иммунная система начинает работать с двух-трехмесячного возраста, поэтому смысла в прививках до этого времени нет. В этом возрасте организм животного наиболее уязвим, поэтому их нельзя выставлять на выставках, продавать, ввозить и вывозить из страны.

Подготовка к вакцинации:

  • На момент вакцинации ваш питомец должен быть полностью здоров.
  • Необходимо проверить состояние слизистой оболочки половых путей и глаз, кожи на животе, в подмышечной области, внутри ушной раковины.
  • Не должно быть сыпи, гнойных выделений, неприятных запахов, так как это признаки вялотекущего хронического инфекционного процесса или аллергической реакции.
  • Также не должно быть ни в коем случае поноса, рвоты, кашля, чихания с гнойными выделениями. Иначе вместо вакцинации необходимо записаться на прием к врачу.
  • За 10-14 дней до прививки необходимо провести дегельминтизацию. Глистогонные препараты в широком ассортименте вы найдёте в аптеках «Доктор Вет». Препараты бывают разных форм – таблетки (дронтал, празицид, празитаб), сахарные кубики (поливеркан), суспензии (празицид-суспензия), пасты (дирофен паста), капли на холку (адвокат, профендер) и др.
    Специалисты помогут вам подобрать препараты с учетом возраста, веса и особенностей животного.
  • Перед и после прививки животное не рекомендуется купать, подвергать физическим нагрузкам и прочим стресс-факторам.
  • Во время иммунизации для животного особенно важно получать полноценное высококачественное питание.

Вакцинация кроликов

Почему важны прививки хорьков?
Прививки помогают защитить вашего хорька от тяжелых инфекционных заболеваний. Это также предотвращает передачу опасных инфекций другим хорькам). Вы должны держать своего хорька дома до тех пор, пока он не будет полностью вакцинирован. В настоящее время в Великобритании нет лицензированных для использования специальных вакцин для хорьков. Вместо этого хорьку вводят вакцину против собачьей чумы. Есть свидетельства того, что это эффективно, хотя его использование не лицензировано, поэтому каждый хорек оценивается индивидуально, чтобы решить, целесообразна ли вакцинация.


Существует небольшой риск реакции на вакцину, который увеличивается с каждой вакцинацией, которую они получают, поэтому мы рекомендуем им оставаться в больнице в течение 20–30 минут после вакцинации, чтобы следить за любыми проблемами. Реакции на вакцины редки и поддаются лечению, но непредсказуемы.

В каком возрасте можно делать прививки хорьку?
Первую вакцинацию хорькам обычно делают в возрасте 12 недель, хотя в случаях высокого риска может быть сделана дополнительная более ранняя вакцинация.

Как часто следует вакцинировать хорьков после их первой прививки?
Ежегодные бустеры для поддержания иммунитета.

От каких болезней хорьков защищает вакцинация?


Прививки для хорьков предназначены для защиты от чумы хорьков

Что такое чумка хорьков?
Чума – редкое, но серьезное заболевание хорьков, которое обычно начинается с кашля, чихания и выделений из глаз и носа и всегда приводит к летальному исходу.

Кто может вакцинировать моего хорька?
Ветеринар проводит осмотр хорька и вакцинацию

Какова стоимость вакцинации хорьков?
Прививки для хорьков начинаются от 47,25 фунтов стерлингов.
Если вы получаете определенные государственные льготы, вы можете иметь право на скидки. Ознакомьтесь с квалификационными критериями в наших условиях и положениях (ССЫЛКА)

Что произойдет, если мой хорек из спасательного центра?

Если вы взяли хорька из благотворительной организации, его часто вакцинируют, прежде чем вы заберете домой.Всегда консультируйтесь с благотворительной организацией и запрашивайте документы о прививках.

Какая документация мне нужна, если мой хорек уже был привит?
Попросите записи о прививках, чтобы вы могли отвезти их к ветеринару, когда им нужно будет сделать ежегодную ревакцинацию хорька, и вы можете отметить годовщину в своем календаре или в своем дневнике!

Где сделать прививку хорьку?
Здесь, в больнице для животных RVC Beaumont Sainsbury, мы предлагаем полную вакцинацию хорьков и услуги по проверке здоровья.

Когда можно сделать прививку хорьку?
Мы предлагаем вакцинацию хорьков с понедельника по пятницу и в выходные дни

Как записаться на вакцинацию хорька?
Во-первых, ваш питомец должен быть у нас зарегистрирован.

  • Чтобы зарегистрироваться онлайн, пожалуйста, заполните регистрационную форму (ССЫЛКА)
  • Для регистрации по телефону – позвоните нам по телефону 0207 387 8134

После того, как ваш питомец будет зарегистрирован, мы можем записать его на прием к прививке – будь то первый курс прививок или ежегодная/ежегодная ревакцинация.

COVID-19 и хорьки | Блог о червях и микробах

Основываясь на том, что мы знали об исходном вирусе SARS, и сходстве с SARS-CoV-2 (причиной COVID-19), мы ожидали, что хорьки будут одним из видов, которые могут быть восприимчивы к заражению последним. Когда хорьки были заражены вирусом атипичной пневмонии, они заболевали (в отличие от кошек, которые просто выделяли вирус). Во всем мире проводятся различные экспериментальные исследования для изучения восприимчивых видов, как для понимания вируса, так и в значительной степени для разработки экспериментальной модели (для таких вещей, как исследования вакцин).

Таким образом, неудивительно, что хорьки восприимчивы к инфекции SARS-CoV-2, как описано в предварительно проверенной рукописи из журнала Cell Host & Microbe (Kim et al. 2020). Это небольшое, но важное исследование.

Короткая версия:

  • Хорьки были экспериментально инфицированы, у них развилась лихорадка, вялость и кашель.
  • Хорьки, находившиеся в непосредственном контакте с инфицированными хорьками, также заболевали.
  • Хорьки в соседних клетках заразились (т. е. вирус передался им), но не заболели, что свидетельствует о том, что вирус распространялся при непрямом контакте, но количество распространяемого вируса, вероятно, было низким и недостаточным, чтобы вызвать болезнь.

Более длинная версия:

  • Они привили вирус интраназально 2 хорькам. Два дня спустя они поместили несколько неинфицированных хорьков в те же клетки и поместили еще несколько неинфицированных хорьков в соседние клетки.
  • Это повторили три раза (всего 6 инфицированных и 12 экспонированных, плюс 6 неинфицированных хорьков в качестве контроля).
  • Кровь, смывы из носа, слюну, мочу и фекалии проверяли на наличие вируса через день в течение 12 дней.
  • После прививки у хорьков развилась лихорадка, снижение активности и периодический кашель.Никто не умер. Вирус можно было обнаружить на 2-й день после заражения, а уровень вируса был самым высоким в выделениях из носа. (Это неудивительно.)
  • Пиковые уровни вируса были на 4-й день и сохранялись до 8-го дня. Все были отрицательными на 10-й день. В дополнение к выделениям из носа, более низкие уровни вируса были обнаружены в слюне, фекалиях и моче на 2-8 дни. Низкие уровни обнаруживались в крови в течение более короткого периода времени.
  • В дополнение к обнаружению вирусных нуклеиновых кислот (т. е. не обязательно живого вируса) с помощью ПЦР был также выделен живой вирус.
    • Это неудивительно, поскольку инфицированные хорьки могли передавать вирус другим хорькам, но, тем не менее, это важное открытие. Исследования, включающие ПЦР, всегда вызывают вопросы о том, был ли обнаружен живой или мертвый вирус. Вирус также был обнаружен в образцах тканей другой группы инфицированных хорьков. В целом, нет сомнений, что эти хорьки действительно были заражены.
  • У всех 6 хорьков, имевших непосредственный контакт с инфицированными хорьками, развилась лихорадка и снизилась активность.Все эти хорьки были инфицированы, так как вирус был обнаружен в образцах из носа на 4-й день после их контакта с экспериментально инфицированными хорьками. Вирус также был обнаружен в слюне и фекалиях.
  • Ни у одного из хорьков, находившихся в непрямом контакте (в соседних клетках), не было признаков болезни. Однако они были заражены. Это поднимает несколько интересных моментов:
    • Одним из них является возможность воздушно-капельной передачи (авторы говорят «воздушно-капельным путем», но я предполагаю, что это маловероятно, и держу пари, что по поводу использования ими этого термина возникнут споры).
    • Другая заключается в том, что более низкий уровень воздействия от непрямого контакта, возможно, объясняет отсутствие заболевания (хотя мы не можем слишком увлекаться выводами, основанными на том, что произошло с 6 здоровыми взрослыми хорьками).
  • Через 12 дней после заражения все хорьки пришли в норму.

Это исследование было сосредоточено на том, чтобы выяснить, будут ли хорьки хорошей экспериментальной моделью (и похоже, что они будут, постоянно болеть, но не серьезно).

Что это означает для домашних хорьков и их владельцев?

Немного сверх того, что мы уже сказали.

  • Если вы заболели, держитесь подальше от своего хорька.
  • Если хорек подвергся воздействию инфицированного человека, держите его подальше от других людей (и других домашних животных).
  • Ветеринары должны продолжать спрашивать владельцев о воздействии COVID-19 в семье, чтобы защитить себя от владельцев, а также учитывать потенциальные проблемы при уходе за своими питомцами.

Какие вакцины подходят для вашего питомца?

Какие вакцины необходимы вашему питомцу?

Обеспокоенность потенциальными побочными эффектами и кумулятивными эффектами вакцин может заставить вас задуматься о том, действительно ли необходимы прививки. Хотя ваш питомец, вероятно, может пропустить некоторые вакцины, другие абсолютно необходимы для хорошего здоровья и профилактики заболеваний.

Почему важны вакцины

Вакцины повышают иммунитет вашего питомца и предотвращают развитие у него серьезных заболеваний, включая бешенство и чумку.Вакцины содержат небольшое количество ослабленных или убитых вирусов. После того, как ваш питомец получит вакцину, у него выработаются антитела к болезни. Если ваша собака, кошка или хорек в будущем подвергнется воздействию вируса, антитела быстро убьют и атакуют вирус, предотвратив заболевание вашего питомца.

Вакцины не только защищают здоровье вашего питомца, но и защищают животных, которые слишком молоды для вакцинации или не могут получить ее из-за определенных заболеваний. Вакцинация замедляет или останавливает распространение болезни, обеспечивая безопасность домашних животных, а иногда и людей.

До того, как была введена вакцина против бешенства, домашние животные и люди, подвергшиеся воздействию вируса, подвергались верной смерти. Благодаря вакцине было спасено бесчисленное количество жизней с момента ее появления в конце 1800-х годов. К сожалению, бешенство по-прежнему убивает тысячи людей и животных в год в тех частях мира, где вакцинация является редкостью.

Какие вакцины нужны моим питомцам?

Собак, кошек и хорьков прививают против болезней, которые с наибольшей вероятностью могут их поразить.Вакцины делятся на две категории: основные и дополнительные. Базовые вакцины защищают вашего питомца от болезней, которые чаще всего встречаются там, где вы живете. Дополнительные вакцины — это необязательные вакцины, которые могут потребоваться в зависимости от факторов риска вашего питомца.

Основные вакцины для собак включают:

  • Аденовирус-2 (аденовирус и гепатит)
  • Чума
  • Парвовирус
  • Бешенство

Распространена ли болезнь Лайма в вашем регионе? Вашей собаке может быть полезна неосновная вакцинация против болезни Лайма. Другие дополнительные вакцины включают бордетеллу (питомниковый кашель), коронавирус, лептоспироз и собачий грипп.

Ваша кошка понадобится эти основные вакцины:

  • Develber
  • Feline Calicivirus
  • CALICIVIRUS
  • FELY HERPESVIRUS Тип 1
  • Rabies
  • Rabies

Fele Immunodefiect Virus, Feline Leukemia, Bordetella и Chlamydophila Vaccians являются неядерными вакцинами, которые могут рекомендуется для некоторых кошек. Например, ваш ветеринар может предложить вакцину против кошачьего лейкоза, если ваш питомец проводит время на открытом воздухе, где он или она может контактировать с кошками, зараженными вирусом.

Основные вакцины вводятся, когда ваш питомец является щенком или котенком, хотя их также можно вводить взрослым животным, которые еще не получили их. Некоторые вакцины необходимо повторять каждый год, в то время как другие действуют в течение трех лет или дольше. График вакцинации против бешенства варьируется в зависимости от законов вашего региона.

Хорьки получают вакцины против чумы и бешенства, но дополнительных вакцин для этих животных не существует.

Что насчет побочных эффектов?

Побочные эффекты могут возникать после вакцинации, но большинство из них легкие и длятся всего день или два.Общие побочные эффекты могут включать умеренную лихорадку, боль в месте инъекции, вялость, снижение аппетита, кашель и чихание.

Немедленно позвоните ветеринару вашего питомца, если у вашего компаньона появились тошнота или рвота, крапивница, затрудненное дыхание, сильный кашель или опухоль вокруг морды, глаз или носа.

К счастью, у большинства животных после вакцинации наблюдаются лишь легкие побочные эффекты. Временный дискомфорт от побочных эффектов намного перевешивает потенциально разрушительные последствия, если у вашего питомца разовьется бешенство, чумка, парвовирус или другие серьезные заболевания.

Не пора ли вакцинировать вашего питомца? Свяжитесь с нами, чтобы запланировать встречу вашего пушистого друга.

Источники:

ASPCA: вакцинация вашего питомца

https://www.aspca.org/pet-care/general-pet-care/vaccinations-your-pet

Consumer Reports: почему это так важно для вакцинации вашей собаки, 17.09.18

https://www.consumerreports.org/pets/why-its-so-important-to-vaccinate-your-dog/

Центры по контролю и профилактике заболеваний: Бешенство в вашем штате?

https://www.cdc.gov/rabies/location/usa/surveillance/index.html

Canine Journal: Какие прививки для собак необходимы?, 21.06.19

https://www.caninejournal.com/dog-vaccinations/

Руководство Merck: Управление хорьками

https://www.merckvetmanual.com/exotic-and-laboratory-animals/ferrets/management-of-ferrets

American Humane: вакцинация вашего питомца

https://www.americanhumane .org/fact-sheet/vaccinating-your-pet/

хорьков - обзор | ScienceDirect Topics

Питание

Хорьки плотоядны и нуждаются в подходящей диете. Рекомендуется диета с высоким содержанием высококачественного животного белка и жира и низким содержанием сложных углеводов и клетчатки. Взрослому, не размножающемуся хорьку требуется от 30% до 40% диетического белка и от 18% до 30% жира. 3 Высококачественный корм для котят или хорьков промышленного производства можно предлагать в виде сухих гранулированных рационов. Следует избегать коммерческих кормов для собак и кошек, так как они не содержат достаточного количества белка и часто содержат белки растительного происхождения. Прием пищи, состоящей из растительных белков, может привести к образованию камней в моче (см. Пищевые болезни).Существует несколько высококачественных коммерческих кормов для хорьков, таких как корм для хорьков премиум-класса Marshall Farms (Marshall Pet Products, Wolcott, NY), Totally Ferret (Performance Foods, Inc., Брумфилд, Колорадо), Mazuri Ferret Diet (Purina Mills). , Inc., Richmond, IN, и Zupreem Premium Ferret Diet (Premium Nutritional Products, Inc. , Mission, KS). Жиры могут быть добавлены с помощью линатона (Lambert Kay, Cranbury, NJ), коммерчески доступной добавки жирных кислот. Лакомство может состоять из кусочков мяса или мясного детского питания.Больному хорьку можно давать Prescription Diet Canine/Feline a/d (Hill's Pet Products, Topeka, KS), Nutri-Cal (EVSCO Pharmaceuticals, Buena, NJ) или Glucerna (Abbott Laboratories, Columbus, OH). высококалорийные пищевые добавки с высоким содержанием жиров. (Дополнительные сведения о пищевых добавках для больных пациентов см. в разделе «Терапевтика».) Хорькам, склонным к образованию комков шерсти в желудке, можно давать от 1 до 2 мл кошачьего лаксатона 2–3 раза в неделю в качестве профилактики. Вода всегда должна быть легко доступна.Это можно сделать с помощью тяжелой миски или бутылочки-поилки. Голодание хорьков для процедур, требующих седации или анализов крови, может быть достигнуто путем воздержания от пищи в течение 4-6 часов. Следует избегать длительного голодания, особенно у хорьков, у которых диагностирована инсулинома, чтобы предотвратить тяжелую гипогликемию.

Границы | Патология и иммунитет после заражения SARS-CoV-2 у самцов хорьков зависят от возраста и пути прививки началась новая пандемия (1).В качестве вмешательства были быстро разработаны и внедрены эффективные вакцины против SARS-CoV-2. Хотя многие из этих вакцин доказали свою эффективность в снижении смертности и заболеваемости (2), по-прежнему вызывает озабоченность тот факт, что мутанты SARS-CoV-2 могут избежать иммунитета, индуцированного вакциной (3). Кроме того, многое остается неизвестным о патологии и долгосрочных последствиях инфекции SARS-CoV-2 и защитного иммунитета. Модели животных необходимы для изучения этих вопросов, и научное сообщество добилось беспрецедентных успехов в их разработке с момента вспышки (4, 5).Тем не менее, все еще остаются некоторые остающиеся пробелы в знаниях, которые ограничивают оценку нерешенных вопросов.

SARS-CoV-2 распространяется при прямом контакте, аэрозолях или каплях (6–9). Вирусная РНК была обнаружена в образцах стула инфицированных людей (10–12), и это подняло вопрос о том, может ли фекально-оральный путь также способствовать передаче SARS-CoV-2 (13). Вирус в основном реплицируется в респираторной ткани, но вирусная РНК была обнаружена во многих других тканях, включая мозг, кишечник, сердце и эндотелиальную оболочку сосудистой системы (12, 14, 15).Инфекция SARS-CoV-2 обычно вызывает легкое заболевание (COVID-19), симптомы которого ограничиваются лихорадкой, сухим кашлем, аносмией/агевзией, миалгией, утомляемостью, одышкой, выделением мокроты, головной болью и иногда диареей [рассмотрено в (16)] . Смертельные случаи характеризуются дыхательной недостаточностью, аритмией, шоком и острым респираторным дистресс-синдромом (15, 17, 18). Смертность значительно увеличивается с возрастом и некоторыми сопутствующими заболеваниями, такими как сердечно-сосудистые заболевания и диабет (15, 17, 19–21). Несмотря на одинаковый уровень инфицирования мужчин и женщин, мужчины чаще подвержены инфекции (17, 19, 20).Некоторые люди дополнительно страдают от «длительного COVID» (постистрый синдром COVID-19), когда у них сохраняются симптомы спустя долгое время после первоначального заражения SARS-CoV-2 (22).

Поскольку хорек ( Mustela putorius furo ) считается лучшей моделью мелких животных для респираторного заболевания, вызванного вирусом гриппа (23, 24), несколько групп исследовали, подходят ли хорьки также для моделирования COVID-19 (25–33). ). Из этих исследований мы знаем, что SARS-CoV-2 эффективно размножается в верхних дыхательных путях (ВДП) хорьков при интраназальном (т.n.) прививка, но репликация в нижних дыхательных путях (НВД) ограничена (25). Однако есть еще много неизвестных относительно модели хорька.

Здесь мы сообщаем о наших усилиях по изучению влияния как возраста, так и пути прививки на инфекцию SARS-CoV-2 на модели хорьков. Поскольку интратрахеальная (i.t.) инокуляция вирусом гриппа вызывает более тяжелое заболевание у хорьков (34–36), мы задались вопросом, можем ли мы смоделировать тяжелую форму COVID-19 у хорьков с помощью i.t. прививка SARS-CoV-2. Кроме того, поскольку пожилой возраст является фактором риска развития тяжелого заболевания (17, 19, 20), мы исследовали роль возраста путем заражения как молодых, так и взрослых хорьков. Мы обнаружили, что инфекция SARS-CoV-2 была более эффективной через внутривенное введение. маршрут и что т.п. прививка и пожилой возраст не привели к более тяжелому заболеванию. Независимо от возраста и пути прививки клинических проявлений заболевания не наблюдалось. Несмотря на отсутствие симптомов, мы обнаружили патологические аберрации в носовых раковинах и легких, которые были более заметными у молодых хорьков и, по-видимому, увеличивались со временем, потенциально отражая длительное течение COVID у людей. Мы также сообщаем, что гуморальный и клеточный иммунный ответ, по-видимому, зависит от достаточной вирусной нагрузки во время острой фазы инфекции.В совокупности наши результаты показывают, что, хотя хорьки могут не подходить для изучения тяжелой формы COVID-19, их можно использовать для моделирования репликации вируса, адаптивных иммунных реакций, бессимптомного течения COVID-19 и, возможно, длительного COVID-19.

Материалы и методы

Заявление об этике

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с законодательством ЕС. Эксперимент был одобрен Органом по защите животных района Антони ван Левенгук (Билтховен, Нидерланды) под номером разрешения AVD3260020184765 Центрального комитета Нидерландов по экспериментам на животных.Хорьки получали пищу и воду вволю и ежедневно осматривались. Если хорьки достигли заранее определенных конечных точек, их усыпили путем сердечного кровотечения под анестезией кетамином (5 мг/кг; Alfasan) и медетомидином (0,1 мг/кг; Orion Pharma). Конечные точки оценивались на основе клинических параметров активности (0 = активный; 1 = активный при стимуляции; 2 = неактивный и 3 = вялый) и нарушения дыхания (0 = нормальное; 1 = учащенное дыхание; 2 = тяжелое/брюшное дыхание). Хорьков подвергали эвтаназии, когда они достигали 3 баллов по уровню активности (вялость) или когда комбинированный балл активности и нарушения дыхания достигал 4.

Культура клеток и вирусов

Клетки VERO E6 культивировали в среде DMEM (Gibco; Thermo Fisher Scientific) с добавлением 1x пенициллина-стрептомицина-глутамина (Gibco) и 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS; HyClone, GE Healthcare). Вирус SARS-CoV-2 был первоначально выделен от голландского пациента (hCoV-19/Netherlands/ZuidHolland_10004/2020) и выращен на клетках VERO E6 в инфекционной среде, состоящей из DMEM, 1x пенициллин-стрептомицин-глутамин и 0% или 2% ФБС. Когда наблюдался >90% цитопатический эффект (CPE), суспензию центрифугировали в течение 10 минут при 4000xg для осаждения клеточного дебриса.Оставшуюся суспензию разделяли на аликвоты и хранили при -80°С. Секвенирование штамма вируса, использованного для заражения, показало, что по сравнению с первичным изолятом не произошло никаких мутаций (идентификатор доступа GISAID: EPI_ISL_454753) и что сайт расщепления фурином сохранился. Вирус паротита дикого типа (MuVi/Utrecht.NLD/40.10; генотип G) выращивали на клетках Vero в среде DMEM (Gibco) с 2% FBS. При >90% CPE супернатант инфицированных клеток Vero центрифугировали при 500xg, фильтровали (размер пор 5 мкм) и аликвоты хранили при -80°C.

Обращение с животными

Молодые (9–10 месяцев) и взрослые (36–48 месяцев) беспородные хорьки-самцы (Schimmel bv, Нидерланды) прибыли в исследовательский центр на животных (ARC, Билтховен, Нидерланды) не менее чем за неделю до начало исследования. С момента прибытия до дня заражения хорьки содержались в открытых клетках по группам. Животных с подтвержденным заражением алеутской болезнью или NL63 помещали в отдельную камеру. Инфекции проводили в изоляторах класса BSL-3, где хорьки оставались до конца эксперимента.Размещение транспондеров температуры и инфицирование проводили под наркозом кетамином (5 мг/кг) и медетомидином (0,1 мг/кг). Бупренодал (0,2 мл; АСТ Фарма) вводили после установки транспондера в качестве послеоперационного анальгетика. Анестезия противодействовала атипамезолу (0,25 мг/кг; Orion Pharma), введение которого откладывалось на 30 минут в случае инфекций, чтобы предотвратить секрецию инокулята при чихании или кашле. Определение веса и взятие мазков производилось под анестезией только кетамином.

Дизайн исследования

Исследование было разделено на три эксперимента (A, B и C), которые были инфицированы SARS-CoV-2 по отдельности. Хорьков в экспериментах А, В и С соответственно вскрывали через 5, 14 и 21 день после заражения. Каждый эксперимент состоял из 4-5 групп по 3 хорька в каждой. Группы определялись по возрасту (молодые и взрослые) и пути заражения (внутриносовые и внутритрахеальные). Из-за нехватки взрослых хорьков в эксперименте Б не было группы с и.н. инфицированных взрослых хорьков.В эксперименты В (молодые хорьки) и С (взрослые хорьки) добавляли дополнительную группу ложно инфицированных для контроля иммунологических анализов и патологии.

В день 0 хорьки были инфицированы i.t. или и.н. с 10 7 TCID 50 SARS-CoV-2, разбавленным в PBS. Ложно инфицированные хорьки получали PBS внутривенно. в одиночестве. Вирус вводили по 0,1 мл внутривенно. и 3 мл для внутривенного введения. До заражения и через день, начиная с 3-го дня, измеряли массу тела и брали мазки из носа, зева и прямой кишки.В конце эксперимента животных усыпляли путем обескровливания посредством пункции сердца под анестезией кетамином и медетомидином. Перед пункцией сердца измеряли массу тела и брали мазки.

Важно отметить, что это исследование имело несколько осложняющих факторов. У поставщика самцов содержали группами по 3 особи. Из-за строгой иерархии, присутствующей в группах самцов хорьков, мы не смогли случайным образом распределить отдельных животных по группам лечения. Вместо этого целые клетки (с 3 животными) были случайным образом распределены для определенного лечения.Перед поступлением в вивариум сыворотки хорьков были проверены Европейской ветеринарной лабораторией (EVL, Нидерланды) на предшествующие инфекции алеутской болезнью, коронавирусом человека NL63, вирусом чумы собак (CDV), вирусом короны кошек (FCoV) и кишечным коронавирусом собак. вирус (CCoV). FCoV и CCoV являются репрезентативными для системных и кишечных короновирусов хорьков соответственно. Почти все животные демонстрировали предшествующее воздействие CDV, и несколько животных дали положительный результат на антитела против NL63, FCoV, CCoV, гриппа и алеутской болезни до начала эксперимента (дополнительная таблица 1). Хорьки с положительным результатом на антитела против гриппа или алеутской болезни были распределены в группы плацебо.

Сбор проб

Во время эксперимента кровь собирали из краниальной полой вены и хранили либо в пробирках VACUETTE с натрий-гепарином, покрытых натрием (Greiner) для клеточных анализов, либо в пробирках VACUETTE с разделителем сыворотки CAT (Greiner) для выделения сыворотки. Кровь хранили при комнатной температуре и анализировали в тот же день. В конце эксперимента кровь собирали путем пункции сердца, после чего группы В и С получали перфузию легких для удаления большинства лимфоцитов из кровотока, которые могли повлиять на клеточные анализы.Нижние 4 см трахеи хранили в формалине для изучения патологии, а средние 1,5 см использовали для определения вирусной нагрузки. Легкие взвешивали, левую черепную долю надували формалином и хранили в 10% забуференном формалине для гистопатологического анализа. Для оценки вирусной РНК и титров TCID 50 0,5 см срезы правой краниальной, средней и каудальной долей собирали в пробирки Lysing Matrix A (MP Biomedicals, Германия). Образцы в пробирках с лизирующей матрицей А хранили при -80°C до проведения анализа.Остальные легкие использовали для иммунологического анализа и хранили в холоде (4°С) но/но до обработки на следующий день.

Из кишечника 1,5 см части подвздошной и верхней части толстой кишки собирали в пробирки с лизирующей матрицей А и формалин для оценки вирусной РНК и патологии соответственно. Затем череп разрезали пополам с помощью колеблющегося лезвия, перемещающегося из каудального в ростральное положение, чтобы предотвратить загрязнение мозговой ткани любыми частицами из ВДП. Носовые раковины слева от перегородки использовались для патологии, а правая сторона использовалась для вирусологии и иммунологии.Наконец, обонятельная луковица (OB) и срезы головного мозга и мозжечка были собраны для вирусологии и патологии. Образцы для патологии, вирусологии и иммунологии хранили соответственно в формалине, пробирках с лизирующей матрицей А и RPMI1640 с добавлением 1x пенициллина-стрептомицина-глутамина.

Мазки из носа и зева собирали в 2 мл буфера для транспортировки, состоящего из 15% сахарозы (Merck), 2,5 мкг/мл амфотерицина В, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 250 мкг/мл гентамицина (все от Sigma).Ректальные мазки хранили в 1 мл S.T.A.R. буфер (Roche). После сбора все мазки встряхивали, разделяли на аликвоты в условиях BSL-3 и хранили при -80°C до дальнейшего анализа. 200 мкл каждого образца добавляли непосредственно во внешний буфер для лизиса MagNA Pure (Hoffmann-La Roche, Базель, Швейцария), встряхивали и хранили при -20°C для RT-qPCR. Образцы, хранившиеся в пробирках Matrix A, размораживали и добавляли 750 мкл инфекционной среды DMEM (DMEM, содержащей 2% FBS и 1x пенициллин-стрептомицин-глутамин). Затем ткани диссоциировали в FastPrep-24™ путем двукратного встряхивания в течение 1 минуты, после чего образцы центрифугировались в течение 5 минут при 4000xg.Из супернатанта 200 мкл использовали для анализа RT-qPCR, как подробно описано выше, и 250 мкл использовали для определения TCID 50 -.

Вскрытие животных, инфицированных SARS-CoV-2, проводилось в условиях BSL-3, и все материалы из мазков, образцов из пробирок с лизирующей матрицей A и носовых раковин обрабатывались в условиях BSL-3. С кровью обращались в условиях BSL-2, поскольку было показано, что ПЦР-отрицательная кровь на SARS-Cov-2. Срезы селезенки и легкого 14 и 21 dpi обрабатывали в условиях BSL-2+, поскольку легочная ткань не содержала инфекционного вируса 5 d.Пи. как показал анализ TCID 50 .

Регистрация температуры

В экспериментах B и C животные получали датчики температуры (Star Oddi, Исландия) за две недели до заражения. Эти датчики регистрировали температуру каждые 30 минут с 7 дней до заражения до конца эксперимента. Лихорадку рассчитывали как отклонение от исходного уровня (ΔT), где исходный уровень относится к средней температуре за 5 дней до заражения SARS-CoV-2.

Патология

Оценка патологии проводилась, как описано ранее (16, 28).После фиксации доли легких заливали парафином и нарезали на срезы толщиной 5 мкм. Предметные стекла окрашивали гематоксилином и эозином и исследовали под микроскопом при 50-кратном или 100-кратном увеличении. Для каждой ткани оценивали не менее 20 микроскопических полей. При оценке патологии различают категории «повреждение эпителия» и «воспаление». Параметры, связанные с повреждением, включали гипертрофию, гиперплазию, уплощенный или псевдоплоскоклеточный эпителий, некроз и оголение эпителия бронхов (долей), гиперемию перегородок и альвеолярную эмфизему и кровоизлияния.Параметры, связанные с воспалением, включали (пери)бронхи(оли)тис, интерстициальный инфильтрат, альвеолит и (пери)васкулит, характеризующиеся полиморфноядерными (ПЯН) клетками, макрофагами и лимфоцитарным инфильтратом. Патологические данные оценивались по шкале от 0 (отсутствие аберраций) до 5 (тяжелое повреждение) и суммировались в две «конечные оценки» для категорий «повреждение эпителия» и «воспаление». Предметные стекла под микроскопом были рандомизированы и слепо оценены опытным патологоанатомом.

Выделение лимфоцитов

Кровь, собранная в натрий-гепариновые пробирки, была разбавлена ​​1:1 PBS (Gibco) и нанесена поверх смеси 1:1 Lymphoprep (1.077 г/мл, Stemcell) и Lymphoyte-M (1,0875 г/мл, Cedarlane). Градиент вращали при 800×g в течение 30 минут и собирали поверхность раздела, содержащую РВМС. Затем клетки дважды промывали промывочной средой (RPMI1640 + 1% FBS) и центрифугировали при 500×g в течение 10 минут (первая промывка) или 5 минут (вторая промывка). После последней стадии промывки клетки ресуспендировали в стимулирующей среде (RPMI1640 + 10% FBS + 1x пенициллин-стрептомицин-глутамин).

На 14-й и 21-й день после заражения легкие умерщвленных животных перфузировали физиологическим раствором для удаления циркулирующих лимфоцитов из легких, как описано ранее (37).Лимфоциты из легких выделяли с помощью ферментативного расщепления. Легкие сначала перерабатывали в маленькие кубики размером примерно 5 мм 3 с помощью ножниц. Затем нарезанную кубиками ткань расщепляли в течение 60 минут при 37°C в 12 мл предварительно нагретой суспензии коллагеназы I (2,4 мг/мл, Merck) и ДНКазы I (1 мг/мл, Novus Biologicals) в RPMI1640 при вращении. Затем ткань гомогенизировали путем осторожного надавливания на сито с помощью поршня 10-миллилитрового шприца. Полученную суспензию разбавляли промывочной средой с добавлением ЭДТА [RPMI1640 + 1% FBS + 2 мМ ЭДТА (Invitrogen)] и фильтровали через сито для клеток 70 мкм.Эту суспензию наносили поверх 15 мл Lympholyte-M в пробирке на 50 мл. Стадии центрифугирования и промывки в плотности выполняли, как описано выше, за исключением того, что в промывочную среду добавляли ЭДТА для предотвращения агглютинации клеток. Пептид Технологии ГмбХ. Каждый пул содержал пептиды длиной 15 аминокислот с перекрытием 11 аминокислот, охватывающих весь белок SARS-CoV-2.Из-за длины белка шипа, PepMix™ шипа был распределен по двум отдельным флаконам, содержащим пептиды 1-158 и 159-315.

Elispot

Планшеты Ferret IFNγ-ELISpot (ALP) с предварительным покрытием (Mabtech) использовали в соответствии с протоколом производителя. На лунку 250 тыс. PBMC или 31,25 тыс. лимфоцитов легких стимулировали живым вирусом (MOI 1) или пулами пептидов SARS-CoV-2 (1 мкг/пептид/мл) в планшетах ELISpot в течение 20 часов при 37°C. Затем планшеты промывали и проявляли в соответствии с протоколом производителя, с той модификацией, что инкубация с первым антителом происходила нон/н при 4°C вместо 2 часов при комнатной температуре.После заключительного этапа промывки планшеты оставляли сохнуть более чем на 2 дня. Затем планшеты упаковывали в условиях BSL-3 и нагревали до 65°C в течение 3 часов, чтобы инактивировать любые оставшиеся частицы SARS-CoV-2. Планшеты анализировали на ImmunoSpot ® S6 CORE (CTL, Cleveland, OH). Подсчет пятен был скорректирован с учетом фоновых сигналов путем вычитания количества пятен в средних условиях из всех других условий. Данные визуализировались в логарифмическом масштабе, поэтому минимальное количество точек было установлено равным «1» для целей визуализации.

Trucount

50 мкл гепариновой крови каждого животного использовали для анализа trucount с помощью набора PerFix-NC без центрифугирования (Beckman Coulter). Клетки сначала окрашивали внеклеточно с помощью α-CD4-APC (02, Sino Biological), α-CD8a-eFluor450 (OKT8, eBioscience) и α-CD14-PE (Tük4; Thermo Fisher) в течение 15 минут при комнатной температуре. Затем клетки фиксировали 5 мкл фиксирующего реагента в течение 15 минут, после чего добавляли 300 мкл пермеабилизирующего реагента. Последующее внутриклеточное окрашивание состояло из α-CD3e-FITC (CD3-12, Biorad) и α-CD79a-APC/eFluor780 (eBioscience).После 15-минутной инкубации при комнатной температуре к каждому образцу добавляли 3 мл реагента Final. Для сокращения времени измерения образцы центрифугировали в течение 5 минут при 500xg и удаляли 2,8 мл суспензии. Осадок ресуспендировали в оставшемся объеме и к каждому образцу добавляли 50 мкл шариков Precision Count (Biolegend) для подсчета абсолютного количества клеток. Образцы измеряли на FACSymphony A3 (BD) и анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo™ V10.6.2 (BD). Пример стратегии стробирования представлен на дополнительном рисунке 1.

Анализ титра вируса

Вирусные штаммы титровали в восьми повторностях на клетках VERO E6 в 96-луночных планшетах. Образцы титровали в среде DMEM, содержащей 2% FBS и 1x пенициллин-стрептомицин-глутамин. Через 6 дней оценивали CPE и рассчитывали значения TCID 50 с использованием метода Reed & Muench. Мазки из носа и горла тестировали аналогичным образом, но в шести повторах с 8 разведениями. Для мазков в среду для титрования добавляли 2,5 мкг/мл амфотерицина В и 250 мкг/мл гентамицина.

RT-qPCR

В буфер для лизиса добавляли вирус лошадиного артериита (EAV) в качестве внутреннего контроля RT-qPCR и хранили при -20°C до добавления материала образца. Суммарную нуклеиновую кислоту экстрагировали из образцов с помощью системы MagNA Pure 96 с использованием набора MagNA Pure 96 DNA и Viral NA Small Volume Kit и элюировали в объеме 50 мкл элюирующего буфера Roche Tris-HCl. Реакция ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени (RT-qPCR) объемом 20 мкл содержала 5 мкл образца нуклеиновой кислоты, 7 мкл 4x Taqman Fast Virus Master Mix (Thermo Fisher), 5 мкл воды без ДНКазы/РНКазы и 3 мкл смеси праймеров и зондов ( последовательности, показанные в таблице 1).Внутренний анализ обнаружения SARS-CoV-2 проводился с использованием праймеров E-гена и зонда, специфичного для бета-коронавирусов, связанных с SARS, как описано Corman et al. (39) и праймеры и зонд внутреннего контроля вируса лошадиного артериита (EAV), как описано Scheltinga et al. (40). Эта RT-qPCR E-гена обнаруживает геномные и субгеномные молекулы РНК SARS-CoV-2. Собственный анализ субгеномной мРНК E-гена проводили с использованием обратного праймера и зонда E-гена и прямого праймера, как описано Zhang et al.(41). Все тесты проводились на Light Cycler 480 I (LC480 I, Roche) в соответствии с протоколом циклирования, подробно описанным в Таблице 2. Были записаны пороговые значения цикла (Ct).

Таблица 1 Праймеры и зонды, использованные в этом исследовании.

Таблица 2 Протокол циклов и температуры для RT-qPCR с E-геном SARS-CoV-2.

Всего нуклеиновых кислот, экстрагированных с помощью системы MagNA Pure 96, использовали для определения экспрессии ACE2 и TMPRSS2 в отдельной реакции. Сначала синтезировали кДНК из выделенной РНК с помощью набора для синтеза кДНК iScript™ (Bio-Rad) в соответствии с протоколом производителя с использованием системы ОТ-ПЦР StepOnePlus (Thermo Fisher). RT-qPCR проводили с использованием 1x Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (Thermo Fisher) на StepOnePlus с праймерами для Cyclophilin A, ACE2, TMPRSS2 и бета-актина (Isogen Life Science, Нидерланды; таблица 1). RT-qPCR выполняли в течение 10 минут при 95°C, затем следовали 40 циклов при 95°C в течение 30 секунд и праймер-специфический отжиг (см. выше) в течение 45 секунд. Затем следовали 95°С в течение 15 секунд, 53°С в течение 60 секунд и 95°С в течение 15 секунд. Объединенный эталонный образец, состоящий из 5-кратных разведений кДНК носовых раковин 6 животных, брали в двух повторностях с каждой RT-qPCR для создания стандартной кривой.Концентрации РНК (в условных единицах) исследуемых образцов интерполировали из стандартной кривой. Относительную экспрессию мРНК генов-мишеней ACE2 и TMPRSS2 рассчитывали путем деления интерполированной произвольной единицы РНК генов-мишеней на среднее геометрическое эндогенных контрольных генов (циклофилин А и бета-актин).

ELISA

96-луночные планшеты Immulon 2 HB (Thermo Fisher) покрывали в течение ночи при комнатной температуре 100 мкл/лунку 0,25 мкг/мл рекомбинантного белка SARS-CoV-2 Spike или домена связывания рецептора Spike (Sinobiology, Китай) и промывали трижды с ПБС+0. 1% Tween-80 перед использованием. Сыворотки сначала разбавляли 1:100 в PBS + 0,1% Tween-80, а затем серийно разбавляли в 2 раза. На лунку добавляли 100 мкл разбавленной сыворотки и планшеты инкубировали в течение 60 минут при 37°С. После трехкратной промывки 0,1% Tween-80 планшеты инкубировали в течение 60 минут при 37°C с HRP-конъюгированным козьим анти-хорьковым IgG (Alpha Diagnostic), разведенным 1:5000 в PBS, содержащем 0,1% Tween-80 и 0,5% Protivar. (Нутриция). Затем планшеты трижды промывали PBS + 0,1% Tween-80 и один раз PBS с последующим проявлением 100 мкл субстрата SureBlue™ TMB (KPL).Развитие останавливали через 10 минут добавлением 100 мкл 2M H 2 SO 4 , и значения OD 450 определяли на считывателе абсорбции EL808 (Bio-Tek Instruments). Отдельные кривые были визуализированы с использованием локальной полиномиальной регрессии с помощью программного обеспечения R (42). Титры антител определяли как разведение, при котором ответы антител снижались ниже фона. Этот фон был рассчитан как «среднее значение + 3 * стандартное отклонение» OD 450 при 400-кратном разведении сыворотки всех животных, протестированных до заражения SARS-CoV-2.

Анализ данных и статистика

Все необработанные данные были проанализированы с помощью описанного выше программного обеспечения. Затем эти данные были экспортированы в Excel и загружены в программу R (42). Анализ данных и визуализация данных проводились с использованием R-пакетов ggplot2 (43), tidyverse (44) и ggpubr (45). Из-за исследовательской цели и небольшого числа групп этого исследования статистический анализ был ограничен. Для большинства анализов группы состояли из 3 хорьков, что мы сочли недостаточным для статистического тестирования.В случае подсчета клеток крови группы могли быть объединены в молодых и взрослых животных. Эти группы были достаточно большими для статистического сравнения, которое было выполнено в R с использованием знакового рангового критерия Уилкоксона и поправки на множественное тестирование по методу Холма-Бонферрони (46).

Результаты

План исследования

В этом исследовании мы оценили роль возраста и пути заражения в заболевании SARS-CoV-2 и иммунитете у хорьков в попытке смоделировать (тяжелый) COVID-19, наблюдаемый у людей.Мы заразили молодых (9–10 месяцев) и взрослых (36–48 месяцев) хорьков-самцов вирусом SARS-CoV-2 посредством интраназальной (внутривенной) или интратрахеальной (ит.) инокуляции (рис. 1А). Чтобы показать, что взрослые хорьки иммунологически отличаются от молодых хорьков, мы провели исходный общий анализ крови. По сравнению с молодыми хорьками количество В- и Т-клеток у взрослых хорьков было ниже (рисунок 1B и дополнительный рисунок 1), что также было описано для пожилых людей (47). Затем хорьков прививали дозой 10 7 TCID 50 , поскольку другие сообщали, что низкой дозы недостаточно для установления инфекции (32).На 5, 14 и 21 день после заражения (dpi) по три животных в группе подвергали эвтаназии для изучения репликации вируса, патологии и иммунных ответов. Из-за ограниченного количества хорьков ни одна взрослая особь i.n. инокулированных животных подвергали эвтаназии через 14 dpi. Ложно инфицированные молодые и взрослые хорьки, инокулированные в.н. с PBS подвергали эвтаназии только на 14 и 21 dpi соответственно.

Рисунок 1 Схема исследования и иммунологический профиль молодых и взрослых хорьков. (A) Молодым и взрослым хорькам интраназально или интратрахеально вводили 10 7 TCID 50 SARS-CoV-2 в день 0.На 5, 14 и 21 день после заражения (dpi) по 3 хорька на группу подвергали эвтаназии. Мнимо инфицированных хорьков подвергали эвтаназии на 14 днях на дюйм (молодые) и 21 день на дюйм (взрослые). Взрослых хорьков, интраназально инокулированных, не подвергали эвтаназии через 14 dpi из-за ограниченной доступности взрослых хорьков. (B) Количество клеток в крови неинфицированных молодых и взрослых хорьков. N = 15 для молодняка и n = 11 для взрослых животных. Блочные диаграммы изображают медиану с первым и третьим квартилями. Различия между молодыми и взрослыми хорьками были протестированы с помощью двухвыборочного теста Уилкоксона и скорректированы для множественного тестирования с использованием метода Холма.Панель (А) была создана с помощью BioRender.

Вирусная нагрузка выше после и.н. Прививка

После и.н. При инфекции SARS-CoV-2 вирусная РНК была высокой в ​​мазках из носа, горла и прямой кишки без различий в возрасте (рис. 2А). Напротив, т. е. инокуляция привела к снижению вирусной нагрузки и явно зависела от возраста, поскольку у молодых животных было измерено меньше вирусной РНК. Вирусная РНК, обнаруженная с помощью RT-qPCR, не обязательно означает наличие инфекционного вируса, поэтому мы определили количество способного к репликации вируса в носу и горле с помощью анализа TCID 50 .Хотя вирусная РНК могла быть обнаружена с помощью RT-qPCR уже через 21 dpi (рис. 2A), инфекционный вирус уже не обнаруживался к 9 dpi (рис. 2B). В. инфекция привела к наивысшему титру вируса в носу и горле. Титры вируса были ниже для i.t. инфицированных хорьков, особенно молодых хорьков, у которых почти все пробы были ниже предела обнаружения.

Рисунок 2 Вирусная нагрузка в мазках и тканях хорьков, инфицированных SARS-CoV-2. (A, B) Вирусная нагрузка, измеренная с помощью RT-qPCR (A) и TCID 50 -анализ (B) в мазках, взятых у хорьков, инфицированных SARS-CoV-2, в разные дни после заражения (dpi) . (C) Вирусная РНК в тканях на 5, 14 и 21 dpi, измеренная с помощью RT-qPCR. (D) Суммарная вирусная РНК на 5 dpi, как показано на (C) , нанесена на график относительно субгеномной вирусной РНК. (E) Инфекционный вирус, обнаруженный с помощью TCID 50 -тест в носовых раковинах и легких 5 dpi. (F) Экспрессия рецептора SARS-CoV-2 ACE2 и протеазы TMPRSS2 в тканях носовых раковин и легких животных, получавших плацебо, в условных единицах (AU). На панелях (A, C, D) RT-qPCR-отрицательных образцов было установлено значение Ct 40 для целей визуализации, что показано пунктирными линиями.На панели (E) пунктирными линиями показано максимальное протестированное разведение. Для (А, Б) n = 3-9. Для (C, F) , за исключением «Adult it» на 14 dpi (n = 2), все группы равны n = 3.

Затем мы измеряли вирусную РНК в различных тканях на 5, 14 и 21 dpi. . Как и в смывах, вирусная РНК была выше практически во всех тканях и.н. инокулированных хорьков при 5 точках на дюйм, независимо от возраста (рис. 2C). Для и.н. инфицированных хорьков, вирусная РНК была высокой в ​​носовых раковинах и низкой в ​​легких.Вопреки нашим ожиданиям, i.t. инокуляция не привела к увеличению количества вирусной РНК в НРТ (легкие и трахея). Вирусная РНК также была обнаружена в кишечнике (подвздошной и толстой кишке) и диссеминирована из исходного очага инфекции в обонятельную луковицу, головной мозг и даже в мозжечок. В этих тканях у хорьков, инфицированных in.n., было обнаружено больше вирусной РНК. Начиная с 5-го дня вирусная РНК снижалась и обнаруживалась лишь спорадически при 21 dpi.

Чтобы проверить, является ли обнаруженная вирусная РНК результатом активной инфекции в месте отбора проб, мы провели как анализ TCID 50 , так и RT-qPCR, специфичный для вирусной субгеномной мРНК.Присутствие вирусной субгеномной мРНК указывает на предыдущую или текущую транскрипцию вируса в инфицированных клетках и было обнаружено в большинстве тканей через 5 dpi (рис. 2D), но впоследствии уменьшилось. К 14 дпи вирусная субгеномная мРНК была обнаружена только в носовых раковинах молодых и.н. инокулированных хорьков, и при 21 dpi все ткани дали отрицательный результат (данные не показаны). Интересно, что хотя наличие субгеномной мРНК указывает на то, что SARS-CoV-2 инфицировал несколько тканей через 5 dpi, это не привело к образованию обнаруживаемых инфекционных вирусных частиц.Анализ с помощью TCID 50 показал, что инфекционный вирус продуцировался только в носовых раковинах при 5 днях на дюйм, при этом инфекционный вирус не обнаруживался в легких, кишечнике или мозге при 5 днях на дюйм или более поздних временных точках (рис. 2E, данные не показаны). Из-за ограниченной доступности тканей титры вируса TCID 50 в носовых раковинах не тестировались на 14 и 21 dpi.

Заражение клеток SARS-CoV-2 зависит от экспрессии связывающего рецептора ACE2 (ангиотензинпревращающий фермент 2) и протеазы слияния TMPRSS2 (трансмембранная протеаза, серин 2) (1, 48, 49).Чтобы определить, можно ли объяснить сниженную репликацию SARS-CoV-2 в LRT молодых животных более низкой экспрессией ACE2 и TMPRSS2, мы количественно определили мРНК ACE2 и TMPRSS2 с помощью RT-qPCR у молодых и взрослых животных, получавших плацебо. Однако экспрессия ACE2 и TMPRSS2 была одинаковой в носовых раковинах и легочной ткани, что указывает на то, что отсутствие репликации SARS-CoV-2 в LRT не было связано со сниженной экспрессией ACE2 или TMPRSS2 (рис. 2F). Взрослые животные, по-видимому, экспрессировали более низкие уровни ACE2 и TMPRSS2, но это не оказывало негативного влияния на вирусную нагрузку (рис. 2A, B).

Патология в ВДП выше для и.

н. Infected Animals

Несмотря на активную репликацию SARS-CoV-2, хорьки не проявляли явных клинических признаков заболевания COVID-19, наблюдаемых у людей. По сравнению с ложно инфицированными животными, инфицированные SARS-CoV-2 животные не теряли больше веса и не испытывали лихорадки (дополнительные рисунки 2A, B), а также не наблюдались изменения дыхательной функции и физической активности. Несмотря на отсутствие клинического заболевания, заражение SARS-CoV-2 действительно приводило к патологическим аберрациям в дыхательных путях, что определялось гистопатологией.

В носовых раковинах патологические аберрации были ограничены респираторным эпителием, выстилающим носо- и верхнечелюстные раковины (рис. 3А). Суб- и интраэпителиальное воспаление приводило к утолщению слизистой оболочки дыхательных путей и экссудату полиморфноядерных клеток, лимфоцитов и некоторых макрофагов. Повреждение эпителиальной выстилки характеризовалось гипертрофией, гиперплазией и плоскоклеточной метаплазией, иногда эпителий отсутствовал. Также присутствовала гипертрофия бокаловидных клеток, иногда наблюдались кровоизлияния.Различные патологические аспекты были разделены на воспаление и повреждение, для которых была определена конечная оценка, как описано ранее (рисунки 3B, C и дополнительный рисунок 3) (50).

Рисунок 3 Инфекция SARS-CoV-2 вызывает более тяжелую патологию ВДП у молодых хорьков. (A) Репрезентативные окрашенные гематоксилином и эозином срезы нормальной, средней (2 балла) и тяжелой (4 балла) пораженной носо- и верхнечелюстной раковины при 100-кратном увеличении. Инфекция SARS-CoV-2 вызывала инфильтрацию полиморфноядерных клеток в собственную пластинку и подслизистую оболочку респираторного эпителия, что приводило к утолщению слизистой оболочки дыхательных путей (обозначено цифрой «1»).Это сопровождалось экссудатом, содержащим слизь (умеренную) и много полиморфноядерных клеток, лимфоцитов и некоторых макрофагов (2). Инфекция вызывала гиперплазию/гипертрофию эпителиальных клеток (3), иногда эпителиальная выстилка отсутствовала (4). Изображения взяты от хорьков, инфицированных SARS-CoV-2, с разрешением 5 («умеренная и тяжелая») или 21 dpi («нормальное»). Бары представляют 100 мкм. (B–D) Оценка по параметрам, связанным с повреждением эпителия (B) , воспалением (C) и процентом ткани, вовлеченной в патологические изменения (D) .Инфекционно-индуцированную патологию оценивали по шкале от 0 до 5 на основании параметров, описанных в материалах и методах. За исключением «Adult i.t.» с разрешением 14 точек на дюйм (n = 2), все группы имеют n = 3, и каждая точка представляет животное.

В целом тяжесть патологии зависела от возраста и пути инфицирования, хотя возрастная корреляция оказалась противоположной нашим ожиданиям. В острой фазе (5 dpi) в.н. у инокулированных хорьков было больше патологических аберраций в носовых раковинах, которые частично разрешились на 14 dpi (рис. 3B, C).Поразительно, что воспаление и, в меньшей степени, повреждение эпителия снова увеличились на 21 dpi у молодых животных, но были менее выражены у взрослых хорьков. Примечательно, что этот эффект был сильнее в i.t. инфицированных молодых хорьков, чем у и.н. заразил молодых хорьков и поразил 100% эпителия носо- и верхнечелюстных раковин (рис. 3D). Таким образом, патология носовых раковин у молодых животных нарастала даже после устранения инфекции.

Путь инокуляции не влияет на патологию LRT

На макроскопическом уровне в легких хорьков, инфицированных SARS-CoV-2, в острой фазе (5 dpi) не было выявлено аберраций, за исключением нескольких более темных пятен.Однако красное опалесцирующее окрашивание вдоль бронхов и в виде отдельных пятен начало появляться на 14 и 21 dpi. В ходе этого исследования не было увеличения веса легких, что указывает на отсутствие серьезного отека (дополнительная фигура 2C). Микроскопически на 5 дпи наблюдался легкий перибронх(олит)ит, характеризующийся наличием инфильтрирующих клеток в подслизистой оболочке вдоль бронхов (рис. 4А). Эпителий бронхов показал некоторую реакцию в виде легкой или незначительной гиперплазии, иногда видимой в виде повторяющихся эпителиальных бугорков. Поразительно, гиперплазия бронх-ассоциированной лимфоидной ткани (БАЛТ) развилась в 1 из 3 и.н. и в 2 из 3 и.т. заразил молодых хорьков на 21 dpi, но отсутствовал у взрослых хорьков. Фолликулярная гиперплазия от легкой до сильной локализовалась в первых ветвях бронха и в более тяжелых случаях распространялась на меньшую бронхиолу (рис. 4А). Обструкция бронхиол происходила регулярно из-за сдавления гиперплазированными фолликулами. Они состояли из активированных лимфоцитов, проникших через мышечный слой бронх(иол)уса в собственную пластинку.Кроме того, хотя и в небольшом количестве, развились локальные очаги легкой и умеренной десквамативной интерстициальной пневмонии. Показатель патологии и процент пораженной паренхимы легкого увеличились с 5 до 21 dpi, в основном у молодых хорьков (рисунки 4B, C и дополнительный рисунок 4). Следует отметить, что молодые животные, которые были исследованы через 21 dpi, дали положительный результат на антитела против NL-63, энтеральных и системных коронавирусов до заражения SARS-CoV-2 (дополнительная таблица 1). Эта комбинация отсутствовала у взрослых хорьков, что усложняло интерпретацию этих результатов.

Рисунок 4 Аспекты патологии легких и трахеи. (A) Репрезентативные окрашенные гематоксилином и эозином срезы нормальных, умеренно и сильно пораженных дыхательных тканей при обзоре, 25-кратное и 200-кратное увеличение. Легкие инфицированных SARS-CoV-2 животных с выраженной гиперплазией бронх-ассоциированной лимфоидной ткани (БАЛТ), состоящей из активированных лимфоцитов, проникающих через мышечный слой бронхов в собственную пластинку и подслизистую оболочку (указаны на цифра с «1»).Также наблюдали гиперплазию бронхиального эпителия в виде повторяющихся бугорков (2), клеточный инфильтрат в подслизистую оболочку (3) и экссудат в просвете (4). Наличие гиперплазированных фолликулов приводило к обструкции бронхиол (5). У некоторых животных наблюдалась десквамативная интерстициальная пневмония с легочными макрофагами в альвеолах и в незначительной степени лимфоцитами и плазматическими клетками (6). Альвеолярный эпителий (пневмоциты) имел плоскоклеточные характеристики. Изображения взяты у хорьков, получавших плацебо («нормальный»), или хорьков, инфицированных SARS-CoV-2, с разрешением 14 или 21 dpi («умеренный», «тяжелый»). (B-D) Патология суммировалась в общем балле от 0 до 5 на основе параметров, описанных в материалах и методах. Оценка патологии (B) и % пораженной ткани (C) для легочной ткани и оценка патологии трахеи (D) . За исключением «взрослых и.т.» на 14 dpi (n = 2), все группы имеют n = 3. (E) Репрезентативные окрашенные гематоксилином и эозином срезы нормальных, умеренно и сильно пораженных предметных стекол ткани трахеи при 200-кратном увеличении.Патологические аберрации в трахее включали гиперплазию (7), повреждение и псевдоплоскоклеточный характер эпителия (8) и инфильтрацию воспалительных клеток в подслизистую оболочку и эпителий трахеи (9). Изображения взяты у инфицированных SARS-CoV-2 хорьков 5 («нормальный») или 21 dpi («умеренный», «тяжелый»).

В соответствии с нашими выводами в легких и носовых раковинах, патология в трахее увеличилась на 21 dpi (рис. 4D и дополнительный рисунок 5).Эпителий трахеи у всех молодых хорьков и у и.т. взрослая группа часто была гиперпластической, а иногда демонстрировала серьезные повреждения и псевдоплоскоклеточные признаки 21 dpi (рис. 4E). Воспалительные клетки инфильтрировали подслизистую оболочку и эпителий, особенно у молодых хорьков. Поскольку вирусная РНК SARS-CoV-2 также была обнаружена в кишечнике, был проведен гистопатологический анализ подвздошной и толстой кишки, но никаких отклонений не наблюдалось. В заключение, независимо от пути инокуляции, у молодых животных наблюдалась более тяжелая патология, чем у взрослых хорьков, как при ВДП, так и при НЗТ, но неясно, связано ли увеличение до 21 дня на дюйм с возрастом или с предшествующим воздействием других коронавирусов.

Клеточный и гуморальный иммунитет

Поскольку у нескольких хорьков, использованных в этом исследовании, до начала исследования наблюдался ответ антител против вирусов хорьков и NL-63 (дополнительная таблица 1), мы задались вопросом, возникают ли перекрестно-реактивные ответы на SARS-CoV. -2 присутствовали у этих животных. Мы измерили реакцию антител против спайкового белка SARS-CoV-2 (S) и его рецептор-связывающего домена (RBD) с помощью ELISA. Клеточные ответы измеряли с помощью IFNγ-ELISpot, в котором PBMC стимулировали живым SARS-CoV-2 или перекрывающимися пептидными пулами S, мембранных (M) и нуклеопротеиновых (N) белков.У трех животных ответ антител против SARS-CoV-2 был чуть выше фона до заражения (дополнительная фигура 6A). Кроме того, другое животное в молодом возрасте i.n. инфицированная группа четко реагировала на перекрывающийся пул пептидов шиповидного белка SARS-CoV-2 в ELISpot в двух разных временных точках до заражения (дополнительная фигура 6B). Это животное дало положительный результат на антитела против короны хорька и NL63, но не против SARS-CoV-2 (дополнительная таблица 1 и дополнительная фигура 6A), что позволяет предположить, что мог иметь место перекрестный реактивный Т-клеточный ответ.Интересно, что у животного наблюдалась аналогичная вирусная кинетика, как и у других животных из той же группы лечения, но у него наблюдалась более тяжелая патология 21 dpi.

После заражения SARS-CoV-2, в.н. инокулированные хорьки продемонстрировали высокий гуморальный ответ как против S, так и против RBD без явных различий между молодыми и взрослыми животными через 14 dpi (рис. 5A). Напротив, титры антител в i.t. инфицированных животных было ниже с четким различием по возрасту. Больше взрослых (4/5), чем молодых (1/6) и.т. инокулированные хорьки проявляли реакцию против S-белка после заражения.Аналогичные результаты были получены для гуморальных ответов против RBD.

Рисунок 5 На клеточный и гуморальный ответы у хорьков, инфицированных SARS-CoV-2, влияет путь инокуляции. (A) Гуморальные ответы, обнаруженные с помощью ELISA, против целого шипа (S) и области рецептор-связывающего домена (RBD) шипа в сыворотке 14 dpi. Ответы представлены в виде (смоделированного) разведения, при котором кривая ELISA опускается ниже фона (среднее значение + 3-кратное стандартное отклонение для животных, ранее не подвергавшихся SARS-CoV-2, при 200-кратном разведении). Пунктирная линия указывает на самое низкое проверенное разведение, а отрицательные образцы были установлены на половину этого разведения для целей визуализации. (B–D) Клеточные ответы в РВМС (B, C) и лимфоцитах легкого (D) по данным IFNγ-ELISpot. Клетки стимулировали пулами пептидов SARS-CoV-2 или живым вирусом. HIV cntrl и Mumps являются отрицательными контролями для пула пептидов и стимуляции вируса соответственно. Показанные здесь данные были скорректированы для среднего фона и были установлены как минимум на 1 точку для визуализации в логарифмической шкале. (B) РВМС, выделенные через 14 или 15 дней после инфицирования (dpi). (C)  Замороженные PBMC, выделенные через 14 или 21 день на дюйм, размораживали и стимулировали пулами пептидов эндемичных коронавирусов человека. (D) Ответы легочных лимфоцитов при 21 dpi. Для b и c образцы были собраны при 14 и 15 или 14 и 21 dpi соответственно, но визуализировались как единая группа. N = 3–6 для панелей (A–C) и n = 3 для панелей (D) . Черные линии указывают (геометрическое) среднее значение по группе.

Затем мы исследовали клеточные ответы при 14 dpi. PBMC в основном реагировали на более крупные пептидные пулы S (S1 и S2), M и N (фиг. 5B). Мы дополнительно измерили ответы против белков оболочки (E) и вспомогательных белков (ORF3a-ORF10), но ответы против этих пулов пептидов были незначительными и не отличались от таковых у наивных животных. В соответствии с низкой вирусной нагрузкой только 1/6 молодых и.т. инфицированные животные реагировали на любой стимул SARS-CoV-2, что свидетельствует о том, что к 14 дпи в этой группе практически не было установлено клеточного иммунитета.Для остальных групп четких различий между путями заражения или возрастом не наблюдалось. Ответы 21 dpi были аналогичны ответам 14 dpi (дополнительная фигура 7A). Поскольку другие сообщали о наличии перекрестно-реактивных Т-клеточных ответов у людей (51–54), мы также проверили, будут ли МНПК от хорьков, инфицированных SARS-CoV-2, реагировать на стимуляцию пулами шиповидных пептидов коронавирусов NL63, OC43, 229E и ХКУ1. У некоторых животных наблюдались незначительные ответы, хотя они были лишь немного выше, чем у ложно инфицированных животных (рис. 5C).

Мы дополнительно исследовали клеточные реакции в легких. Для уменьшения контаминации легочных лимфоцитов циркулирующими лимфоцитами легкие перфузировали физиологическим раствором на 14 и 21 дпи. По сравнению с PBMC, ответы на меньшие пулы пептидов SARS-CoV-2, по-видимому, были более заметными в лимфоцитах легких молодых и.н. зараженные животные. В этой группе два из трех хорьков продемонстрировали ответы против пептидных пулов ORF3a, ORF6, ORF8, ORF9b и ORF10 при 21 дпи (рис. 5D). Как и в РВМС, клеточные ответы отсутствовали в легком i.т. инфицированных молодых хорьков. Следует отметить, что ответы в легких i.t. инфицированные старые животные различались между 14 и 21 днем ​​​​после заражения, при этом ответы в целом были выше на 21 dpi (рис. 5D и дополнительная фигура 7B). Однако размер группы (n = 2-3) был слишком мал для надежной статистической проверки.

Обсуждение

В этом исследовании мы использовали модель мужского хорька для оценки влияния возраста и пути заражения на заболевание и иммунитет SARS-CoV-2. Интраназальная инокуляция была более эффективной в установлении инфекции по сравнению с интратрахеальным введением.Особенно это касалось молодых хорьков, у которых вирус практически не реплицировался после заражения. прививка. Напротив, заболеваемость и патология не увеличивались у старых животных или при интратрахеальной инокуляции.

Несмотря на продуктивную инфекцию SARS-CoV-2, у хорьков не развилось симптоматическое заболевание, характерное для людей (рассмотрено в (16)). К концу исследования у некоторых животных наблюдалась немного более водянистая дефекация, но случаев было слишком мало, чтобы с уверенностью отнести это к инфекции SARS-CoV-2.Однако мы обнаружили геномную РНК и субгеномную мРНК SARS-CoV-2 в ректальных мазках и тканях кишечника в различные моменты времени. Субгеномная мРНК SARS-CoV-2 указывает на вирусную инфекцию, что позволяет предположить, что SARS-CoV-2 действительно обладает энтеротропным действием у хорьков, как и у людей (14, 55–58). Кроме того, наличие вирусной геномной РНК и субгеномной мРНК в обонятельной луковице, головном мозге и мозжечке хорьков согласуется с сообщениями о том, что SARS-CoV-2 может инфицировать ЦНС пациентов (14, 59, 60).Инфекция обонятельной луковицы может объяснить аносмию, часто встречающуюся у пациентов с COVID-19. Однако важно отметить, что, хотя наличие субгеномной мРНК указывает на инфекцию различных тканей, при измерении с помощью анализа TCID 50 инфекционного вируса не было. В связи с этим возникает вопрос, полностью ли отсутствует продукция инфекционного вируса в этих тканях или происходит только в течение первых нескольких дней после инокуляции.

Отсутствие клинического заболевания в этом исследовании соответствует предыдущим исследованиям хорьков SARS-CoV-2.В этих исследованиях масса тела не снижалась после инфицирования, хотя в некоторых случаях наблюдалось снижение активности (25, 29, 32). Лихорадка наблюдалась в одних исследованиях (25, 27), но не в других (29, 32, 33). Таким образом, хорьки не моделируют тяжелые аспекты COVID-19. Несмотря на это знание, мы инициировали это исследование, потому что существующие исследования не изучали интратрахеальную инокуляцию у (старых) самцов хорьков. Ши и др. провели интратрахеальную инфекцию у самок хорьков и обнаружили вирусную РНК в носовых раковинах и трахее, но не в легких (30).В нашем исследовании взрослые самцы хорьков демонстрировали более высокие титры вируса после и.т. инфекции по сравнению с молодыми хорьками, что указывает на то, что возраст повышает восприимчивость к LRT-инфекции SARS-CoV-2 в модели хорьков. Мы предположили, что снижение репликации вируса в LRT, особенно у молодых хорьков, может быть связано с дифференциальной экспрессией рецепторов SARS-CoV-2 ACE2 и TMPRSS2 (1, 49). Однако это, по-видимому, не так, поскольку экспрессия ACE2 и TMPRSS2 была одинаковой в тканях носовых раковин и легочной ткани, а молодые хорьки на самом деле экспрессировали больше ACE2 и TMRPSS2, чем взрослые хорьки.Таким образом, представляется, что факторы, отличные от экспрессии рецептора, предотвращают успешную репликацию SARS-CoV-2 в LRT молодых хорьков. Другие возрастные факторы, которые, как считается, влияют на репликацию SARS-CoV-2, включают иммунную систему, наличие сопутствующих заболеваний и состояние эндотелия сосудов (61). Дальнейшие исследования могут прояснить, в какой степени эти переменные влияют на реакцию хорьков на инфекцию SARS-CoV-2.

Несмотря на отсутствие клинических симптомов, мы и другие исследователи (30, 32) обнаружили патологические отклонения у инфицированных хорьков.В то время как SARS-CoV-2 менее эффективно размножался у молодых и.т. инокулированных животных, и адаптивный иммунный ответ почти не индуцировался, у них проявлялась наиболее пораженная патология. Однако важно отметить, что все молодые хорьки, усыпленные на 21 дпи, дали положительный результат на антитела против короны хорька и NL63 до заражения SARS-CoV-2. Мы не можем исключить, что это могло иметь эффект, и было постулировано, что существующие перекрестные иммунные реакции могут ухудшить исход болезни COVID-19 (62).Райан и др. также обнаружили, что патология все еще увеличивалась между 14 и 21 dpi, хотя они не сообщали об иммунном статусе своих хорьков для других коронавирусов. Заманчиво предположить, что нарастание патологии после заражения SARS-CoV-2 отчасти напоминает аспекты длительного COVID, которые были описаны у выздоравливающих пациентов (22, 63–65). Эти пациенты страдают от последствий в течение нескольких месяцев после первоначального заражения SARS-CoV-2. Хотя симптомы разнообразны, одышка является относительно частым явлением.Теоретически гиперплазия BALT, которую мы наблюдали у хорьков, и возникающее в результате сужение бронхов (долей) могут вызывать одышку, хотя пока нет доказательств того, что это является причиной одышки у пациентов, страдающих длительным COVID.

После заражения SARS-CoV-2 мы обнаружили антитела к S-белку SARS-CoV-2 и RBD. Титры антител были самыми высокими в т.н. инфицированных хорьков, низкий уровень у взрослых и.т. инфицированных животных и отсутствует у большинства молодняка и.т. зараженные животные. Это говорит о том, что для сероконверсии требуется достаточная репликация вируса, поскольку хорьки с более низкой вирусной нагрузкой также демонстрировали более низкий гуморальный ответ. Это было особенно ясно в ИТ. молодой группе, где единственный хорек, у которого развился гуморальный и клеточный иммунитет, также обладал наивысшим титром репликативно-компетентного вируса. Клеточные ответы также были наиболее сильными в i.n. привитые хорьки. Подобно клеточным реакциям выздоравливающих пациентов (54, 66), большинство реакций у хорьков были направлены против белков S, M и N. Как у хорьков, так и у людей (54, 66) практически не наблюдалось реакции на белок Е. Клеточные реакции на несколько дополнительных белков SARS-CoV-2 в крови были ограничены, но лимфоциты легких реагировали на некоторые из этих пулов пептидов.Вероятно, относительное количество Т-клеток, специфичных для SARS-CoV-2, выше в легких, что повышает чувствительность анализа ELISpot. Поскольку перекрестно-реактивные клеточные ответы на SARS-CoV-2 были описаны у людей (51–54), мы также измерили ответы в крови на пулы пептидов S-белков других коронавирусов. Однако ответы были низкими, и интерпретация результатов потребует большего размера группы и более чувствительных анализов.

В связи с глобальными обстоятельствами на момент проведения этого исследования в экспериментальной установке присутствует несколько предостережений.Доступность (самцов) хорьков была ограничена, поэтому мы не могли исследовать все группы в каждый момент времени. Кроме того, несколько хорьков ранее подвергались воздействию алеутской болезни и других коронавирусов, кроме SARS-CoV-2 (подробности в дополнительных данных). Хотя мы не нашли доказательств того, что эта история инфекции повлияла на наши результаты, мы не можем полностью исключить такую ​​возможность. Наконец, из-за ограниченной доступности животных будет сложно смоделировать инфекции SARS-CoV-2 у старых хорьков.Однако, поскольку мы не обнаружили сильных различий между молодыми и взрослыми хорьками при интраназальной инокуляции, использование молодых хорьков должно быть достаточным для будущих экспериментов.

Как обсуждалось здесь, хорьки легко заражаются SARS-CoV-2, но не проявляют клинических симптомов. Таким образом, инфицированные хорьки могут представлять бессимптомный COVID-19, который проявляется у значительной части населения (67). Кроме того, нарушенный иммунный ответ в дыхательных путях у хорьков может моделировать долгосрочные респираторные эффекты, наблюдаемые у пациентов с длительным течением COVID, хотя для подтверждения этого требуются более глубокие исследования.Наконец, с помощью недавно разработанных реагентов для гуморальной и клеточной иммунологии на модели хорьков (37, 68–71) можно количественно оценить вызванные вакциной иммунные реакции и измерить их влияние на репликацию вируса и патологию. Эта зрелая модель хорька может помочь улучшить наше понимание SARS-CoV-2, тем самым стимулируя разработку новых методов лечения и вакцин.

Заявление о доступности данных

Все файлы необработанных данных хранятся внутри компании на резервных серверах и доступны по разумному запросу соответствующему автору.Последовательность изолята SARS-CoV-2 можно найти в GISAID (идентификатор доступа: EPI_ISL_454753). Корреспонденция и запросы на материалы должны быть адресованы JdJ.

Заявление об этике

Исследование на животных было рассмотрено и одобрено Органом защиты животных округа Антони ван Левенгук.

Вклад авторов

Концептуализация: KV и JJ. Методология: KV и JJ. Расследование: KV, HD, LW, AG, TS, JK и SL. Формальный анализ: KV, PR, PK и JJ.Визуализация: КВ. Наблюдение: JJ и PK. Написание — первоначальный вариант: KV, JJ и PK. Написание — обзор и редактирование: KV, JJ, PK, AM и PR. Все авторы внесли свой вклад в статью и одобрили представленную версию.

Финансирование

Эта работа финансировалась Министерством здравоохранения, социального обеспечения и спорта Нидерландов (VWS).

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Примечания издателя

Все претензии, изложенные в этой статье, принадлежат исключительно авторам и не обязательно представляют претензии их дочерних организаций или издателя, редакторов и рецензентов. Любой продукт, который может быть оценен в этой статье, или претензии, которые могут быть сделаны его производителем, не гарантируются и не поддерживаются издателем.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Габриэля Годерски за выделение и выращивание исходного изолята SARS-CoV-2 и Йеруна Кремера за секвенирование.Мы также благодарны Джосиену Ланфермейеру за помощь во время секций животных, биотехникам из виварии за отличный уход за животными и доктору Виллему Луйтьесу за критический обзор рукописи.

Дополнительный материал

Дополнительный материал к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2021.750229/full#supplementary-material

Ссылки

1. Zhou P , Yang XL, Wang XG, Hu B, Zhang L, Zhang W и др.Вспышка пневмонии, связанная с новым коронавирусом вероятного происхождения от летучих мышей. Природа (2020) 579(7798):270–3. doi: 10.1038/s41586-020-2012-7

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

4. Munoz-Fontela C, Dowling WE, Funnell SGP, Gsell PS, Riveros-Balta AX, Albrecht RA, et al. Животные модели для COVID-19. Природа (2020) 586(7830):509–15. doi: 10.1038/s41586-020-2787-6

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

6.ВОЗ. Передача SARS-CoV-2: последствия для мер предосторожности по профилактике инфекций . ВОЗ (2020 г.).

Google Scholar

8. Tang S, Mao Y, Jones RM, Tan Q, Ji JS, Li N, et al. Аэрозольная передача SARS-CoV-2? Доказательства, профилактика и контроль. Environ Int (2020) 144:106039. doi: 10.1016/j.envint.2020.106039

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

11. Zheng S, Fan J, Yu F, Feng B, Lou B, Zou Q, et al. Динамика вирусной нагрузки и тяжесть заболевания у пациентов, инфицированных SARS-CoV-2, в провинции Чжэцзян, Китай, январь-март 2020 г.: ретроспективное когортное исследование. BMJ (2020) 369: m1443. doi: 10.1136/bmj.m1443

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

12. Wolfel R, Corman VM, Guggemos W, Seilmaier M, Zange S, Muller MA, et al. Вирусологическая оценка госпитализированных пациентов с COVID-2019. Природа (2020) 581(7809):465–9. doi: 10.1038/s41586-020-2196-x

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

13. Амириан Э.С. Возможная фекальная передача SARS-CoV-2: текущие данные и значение для общественного здравоохранения. Int J Infect Dis (2020) 95:363–70. doi: 10.1016/j.ijid.2020.04.057

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

14. Schurink B, Roos E, Radonic T, Barbe E, Bouman CSC, de Boer HH, et al. Вирусное присутствие и иммунопатология у пациентов со смертельным исходом COVID-19: проспективное когортное исследование вскрытия. Ланцет Микроб (2020) 1(7):e290–9. doi: 10.1016/s2666-5247(20)30144-0

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

15.Чжоу Ф., Ю. Т., Ду Р., Фан Г., Лю Ю., Лю З. и др. Клиническое течение и факторы риска смертности взрослых стационарных пациентов с COVID-19 в Ухане, Китай: ретроспективное когортное исследование. Ланцет (2020) 395 (10229): 1054–62. doi: 10.1016/s0140-6736(20)30566-3

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

16. Ge H, Wang X, Yuan X, Xiao G, Wang C, Deng T и другие. Эпидемиология и клиническая информация о COVID-19. Eur J Clin Microbiol Infect Dis (2020) 39(6):1011–9.doi: 10.1007/s10096-020-03874-z

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

17. Du Y, Tu L, Zhu P, Mu M, Wang R, Yang P, et al. Клинические особенности 85 смертельных случаев COVID-19 из Ухани. Ретроспективное обсервационное исследование. Am J Respir Crit Care Med (2020) 201(11):1372–9. doi: 10.1164/rccm.202003-0543OC

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

18. Bradley BT, Maioli H, Johnston R, Chaudhry I, Fink SL, Xu H, et al.Гистопатология и ультраструктурные данные о смертельных инфекциях COVID-19 в штате Вашингтон: серия случаев. Ланцет (2020) 396 (10247): 320–32. doi: 10.1016/s0140-6736(20)31305-2

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

19. Cdc Weekly C. Эпидемиологические характеристики вспышки новых коронавирусных заболеваний (COVID-19) в 2019 г. — Китай, 2020 г. China CDC Weekly (2020) 2(8):113–22. doi: 10.46234/ccdcw2020.032

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

20.Карагианнидис С., Мостерт С., Хентшкер С., Вошаар Т., Мальзан Дж., Шиллингер Г. и др. Характеристики случаев, использование ресурсов и результаты лечения 10 021 пациента с COVID-19, госпитализированных в 920 больниц Германии: обсервационное исследование. Lancet Respir Med (2020) 8(9):853–62. doi: 10.1016/s2213-2600(20)30316-7

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

21. Verity R, Okell LC, Dorigatti I, Winskill P, Whittaker C, Imai N, et al. Оценки тяжести коронавирусной болезни в 2019 г.: модельный анализ. Lancet Infect Dis (2020) 20(6):669–77. doi: 10.1016/s1473-3099(20)30243-7

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

23. Белсер Дж.А., Кац Дж.М., Тампи Т.М. Хорек как модельный организм для изучения вирусной инфекции гриппа А. Dis Models Mech (2011) 4: 575–9. doi: 10.1242/dmm.007823

Полный текст CrossRef | Google Scholar

24. Bodewes R, Rimmelzwaan GF, Osterhaus AD. Животные модели для доклинической оценки потенциальных вакцин против гриппа. Expert Rev Vaccines (2010) 9(1):59–72. doi: 10.1586/erv.09.148

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

25. Kim YI, Kim SG, Kim SM, Kim EH, Park SJ, Yu KM и другие. Инфекция и быстрая передача SARS-CoV-2 у хорьков. Микроб-хозяин клетки (2020) 27(5):704–9.e2. doi: 10.1016/j.chom.2020.03.023

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

26. Liu HL, Yeh IJ, Phan NN, Wu YH, Yen MC, Hung JH, et al.Генные сигнатуры легких хорьков, инфицированных SARS-CoV/SARS-CoV-2, в краткосрочных и долгосрочных моделях. Infect Genet Evol (2020) 85:104438. doi: 10.1016/j.meegid.2020.104438

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

27. Park SJ, Yu KM, Kim YI, Kim SM, Kim EH, Kim SG и др. Противовирусная эффективность одобренных FDA препаратов против инфекции SARS-CoV-2 у хорьков. mBio (2020) 11(3):e01114–20. doi: 10.1128/mBio.01114-20

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

28.Richard M, Kok A, de Meulder D, Bestebroer TM, Lamers MM, Okba NMA, et al. SARS-CoV-2 передается через контакт и через по воздуху между хорьками. Нацкоммуна (2020) 11(1):3496. doi: 10.1038/s41467-020-17367-2

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

29. Schlottau K, Rissmann M, Graaf A, Schön J, Sehl J, Wylezich C, et al. SARS-CoV-2 у фруктовых летучих мышей, хорьков, свиней и кур: экспериментальное исследование передачи. Ланцет Микроб (2020) 1(5):e218–25. doi: 10.1016/s2666-5247(20)30089-6

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

30. Shi J, Wen Z, Zhong G, Yang H, Wang C, Huang B, et al. Восприимчивость хорьков, кошек, собак и других домашних животных к коронавирусу SARS 2. Science (2020) 368(6494):1016–20. doi: 10.1126/science.abb7015

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

31. Wu S, Zhong G, Zhang J, Shuai L, Zhang Z, Wen Z, et al. Одна доза вакцины с вектором аденовируса обеспечивает защиту от заражения SARS-CoV-2. Нацкоммуна (2020) 11(1):4081. doi: 10.1038/s41467-020-17972-1

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

32. Ryan KA, Bewley KR, Fotheringham SA, Slack GS, Brown P, Hall Y, et al. Дозозависимый ответ на инфекцию SARS-CoV-2 в модели хорьков и доказательства защитного иммунитета. Нацкоммуна (2021) 12(1):81. doi: 10.1038/s41467-020-20439-y

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

33. Everett HE, Lean FZX, Byrne AMP, van Diemen PM, Rhodes S, James J и др. Интраназальное заражение хорьков SARS-CoV-2 как модель бессимптомной инфекции человека. Вирусы (2021) 13(1):113. doi: 10.3390/v13010113

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

34. Kreijtz JH, Kroeze EJ, Stittelaar KJ, de Waal L, van Amerongen G, van Trierum S, et al. Низкопатогенный вирус птичьего гриппа A(H7N9) вызывает высокую смертность хорьков при интратрахеальном заражении: модель для изучения стратегий вмешательства. Вакцина (2013) 31(43):4995–9. doi: 10.1016/j.vaccine.2013.06.071

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

35. де Йонге Дж., Исакова-Сивак И., ван Дейкен Х., Спийкерс С., Мутхан Дж., де Йонг Р. и др. Живая аттенуированная вакцина против гриппа H7N9 обладает высокой иммуногенностью, предотвращает репликацию вируса и защищает хорьков от тяжелой бронхопневмонии. Мол Тер (2016) 24:1–12. doi: 10. 1038/mt.2016.23

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

36.Bodewes R, Kreijtz JHCM, Van Amerongen G, Fouchier RAM, Osterhaus ADME, Rimmelzwaan GF, et al. Патогенез вирусной инфекции гриппа A/H5N1 у хорьков различается при интраназальном и интратрахеальном способах заражения. Am J Pathol (2011) 179:30–6. doi: 10.1016/j.ajpath.2011.03.026

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

37. van de Ven K, de Heij F, van Dijken H, Ferreira JA, de Jonge J. Системные и респираторные T-клетки, индуцированные сезонным гриппом h2N1, защищают хорьков от пандемии h3N2. Commun Biol (2020) 3(1):564. doi: 10.1038/s42003-020-01278-5

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

38. Fang Y, Rowe T, Leon AJ, Banner D, Danesh A, Xu L, et al. Молекулярная характеристика адъювантной активности In Vivo у хорьков, вакцинированных против вируса гриппа. J Virol (2010) 84(17):8369–88. doi: 10.1128/JVI.02305-09

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

39. Corman VM, Landt O, Kaiser M, Molenkamp R, Meijer A, Chu DK, et al.Обнаружение нового коронавируса 2019 года (2019-Ncov) с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени. Euro Surveill (2020) 25(3):2000045. doi: 10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045

CrossRef Полный текст | Google Scholar

40. Scheltinga SA, Templeton KE, Beersma MF, Claas EC. Диагностика метапневмовируса и риновируса человека у пациентов с инфекциями дыхательных путей с помощью мультиплексной РНК-ПЦР в реальном времени с внутренним контролем. J Clin Virol (2005) 33(4):306–11. doi: 10.1016/j.jcv.2004.08.021

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

41. Zhang Y, Huang K, Xie D, Lau JY, Shen W, Li P, et al. In Vivo Структура и геном РНК SARS-CoV-2. Нацкоммуна (2021) 12(1):5695. doi: 1038/s41467-021-25999-1

Реферат PubMed | Google Scholar

42. R Core Team. R: Язык и среда для статистических вычислений. R Фонд статистических вычислений . (2020).

Google Scholar

43.Уикхем Х. Ggplot2: элегантная графика для анализа данных . Нью-Йорк: Springer-Verlag (2016).

Google Scholar

44. Wickham H, Averick M, Bryan J, Chang W, McGowan L, François R, et al. Добро пожаловать в Tidyverse. J Программное обеспечение с открытым исходным кодом (2019) 4(43):1686. doi: 10.21105/joss.01686

Полный текст CrossRef | Google Scholar

45. Кассамбара А. Ggpubr: Готовые к публикации графики на основе Ggplot2 CRAN . (2020).

Google Scholar

46.Холм С. Простая последовательно отвергающая множественная тестовая процедура. Скандинавский J Stat (1979) 6(2):65–70.

Google Scholar

47. Sansoni P, Cossarizza A, Brianti V, Fagnoni F, Snelli G, Monti D, et al. Подмножества лимфоцитов и активность естественных клеток-киллеров у здоровых пожилых людей и долгожителей. Кровь (1993) 82(9):2767–73. doi: 10.1182/blood.V82.9.2767.2767

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

48. Peacock TP, Goldhill DH, Zhou J, Baillon L, Frize R, Swann OC, et al.Сайт расщепления фурином в шиповидном белке SARS-CoV-2 необходим для передачи инфекции хорькам. Nat Microbiol (2021) 6(7):899–909. doi: 10.1038/s41564-021-00908-w

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

49. Hoffmann M, Kleine-Weber H, Schroeder S, Kruger N, Herrler T, Erichsen S, et al. Проникновение в клетку SARS-CoV-2 зависит от ACE2 и TMPRSS2 и блокируется клинически проверенным ингибитором протеазы. Сотовый (2020) 181 (2): 271–80.e8. дои: 10.1016/j.cell.2020.02.052

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

50. Исакова-Сивак И., де Йонге Дж., Смолоногина Т., Рекстин А., ван Амеронген Г., ван Дейкен Х. и др. Разработка и доклиническая оценка двух штаммов ЖГВ против потенциально пандемического вируса гриппа h3N2. PLoS One (2014) 9(7):e102339. doi: 10.1371/journal.pone.0102339

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

51. Braun J, Loyal L, Frentsch M, Wendisch D, Georg P, Kurth F, et al.SARS-CoV-2-реактивные Т-клетки у здоровых доноров и пациентов с COVID-19. Природа (2020) 587(7833):270–4. doi: 10.1038/s41586-020-2598-9

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

52. Mateus J, Grifoni A, Tarke A, Sidney J, Ramirez SI, Dan JM, et al. Избирательные и перекрестно-реактивные Т-клеточные эпитопы SARS-CoV-2 у людей, не подвергшихся воздействию. Наука (2020) 370(6512):89–94. doi: 10.1126/science.abd3871

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

53.Ле Берт Н., Тан А.Т., Кунасегаран К., Там СИЛ, Хафези М., Чиа А. и др. SARS-CoV-2-специфический Т-клеточный иммунитет в случаях COVID-19 и SARS, а также неинфицированные контроли. Природа (2020) 584(7821):457–62. doi: 10.1038/s41586-020-2550-z

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

54. Grifoni A, Weiskopf D, Ramirez SI, Mateus J, Dan JM, Moderbacher CR, et al. Мишени ответа Т-клеток на коронавирус SARS-CoV-2 у людей с заболеванием COVID-19 и у лиц, не подвергшихся воздействию. Cell (2020) 181(7):1489–501.e15. doi: 10.1016/j.cell.2020.05.015

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

55. Hanley B, Naresh KN, Roufosse C, Nicholson AG, Weir J, Cooke GS, et al. Гистопатологические данные и вирусный тропизм у британских пациентов с тяжелым смертельным исходом COVID-19: посмертное исследование. Ланцет Микроб (2020) 1(6):e245–53. doi: 10.1016/s2666-5247(20)30115-4

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

56.Lamers MM, Beumer J, van der Vaart J, Knoops K, Puschhof J, Breugem TI, et al. SARS-CoV-2 продуктивно инфицирует энтероциты кишечника человека. Наука (2020) 369(6499):50–4. doi: 10.1126/science.abc1669

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

57. Cuicchi D, Lazzarotto T, Poggioli G. Фекально-оральная передача SARS-CoV-2: обзор лабораторно подтвержденного вируса в желудочно-кишечной системе. Int J Colorectal Dis (2020) 36(3):437–44. doi: 10.1007/s00384-020-03785-7

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

58.Cheung KS, Hung IFN, Chan PPY, Lung KC, Tso E, Liu R, et al. Желудочно-кишечные проявления инфекции SARS-CoV-2 и вирусная нагрузка в образцах фекалий из Гонконгской когорты: систематический обзор и метаанализ. Гастроэнтерология (2020) 159(1):81–95. doi: 10.1053/j.gastro.2020.03.065

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

59. Сун Э., Чжан С., Исраэлоу Б., Лу-Куллиган А., Прадо А.В., Скрябин С. и др. Нейроинвазия SARS-CoV-2 в мозг человека и мыши. J Exp Med (2021) 218(3):e20202135. doi: 10.1084/jem. 20202135

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

60. Meinhardt J, Radke J, Dittmayer C, Franz J, Thomas C, Mothes R, et al. Обонятельная трансмукозальная инвазия SARS-CoV-2 как порт входа в центральную нервную систему у людей с COVID-19. Nat Neurosci (2021) 24(2):168–75. doi: 10.1038/s41593-020-00758-5

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

61.Циммерманн П., Кертис Н. Почему COVID-19 протекает менее тяжело у детей? Обзор предполагаемых механизмов, лежащих в основе возрастных различий в тяжести инфекций SARS-CoV-2. Arch Dis Child (2020) 106: 429–39. doi: 10.1136/archdischild-2020-320338

Полный текст CrossRef | Google Scholar

63. Zhao YM, Shang YM, Song WB, Li QQ, Xie H, Xu QF и др. Последующее исследование легочной функции и связанных с ней физиологических характеристик выживших после COVID-19 через три месяца после выздоровления. EClinicalMedicine (2020) 25:100463. doi: 10.1016/j.eclinm.2020.100463

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

64. Dennis A, Wamil M, Alberts J, Oben J, Cuthbertson DJ, Wootton D, et al. Полиорганные нарушения у лиц с низким уровнем риска и пост-COVID-19-синдромом: проспективное исследование на базе сообщества. BMJ Open (2021) 11(3):e048391. doi: 10.1136/bmjopen-2020-048391

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

65.Аюбхани Д., Хунти К., Нафилян В., Мэддокс Т., Хамберстон Б., Даймонд И. и др. Постковидный синдром у лиц, госпитализированных с Covid-19: ретроспективное когортное исследование. BMJ (2021) 372:n693. doi: 10.1136/bmj.n693

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

66. Peng Y, Mentzer AJ, Liu G, Yao X, Yin Z, Dong D, et al. Т-клетки CD4+ и CD8+ с широкой и сильной памятью, индуцированные SARS-CoV-2 у выздоравливающих лиц в Великобритании после COVID-19. Nat Immunol (2020) 21(11):1336–45. doi: 10.1038/s41590-020-0782-6

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

67. Gao Z, Xu Y, Sun C, Wang X, Guo Y, Qiu S, et al. Систематический обзор бессимптомных инфекций COVID-19. J Microbiol Immunol Infect (2021) 54(1):12–6. doi: 10.1016/j.jmii.2020.05.001

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

68. DiPiazza A, Richards K, Batarse F, Lockard L, Zeng H, García-Sastre A, et al. Проточная цитометрия и цитокиновый ELISpot подходы к характеристике клеточно-опосредованного иммунного ответа у хорьков после заражения вирусом гриппа. J Virol (2016) 90:7991–8004. doi: 10.1128/JVI.01001-16

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

69. Music N, Reber AJ, Lipatov AS, Kamal RP, Blanchfield K, Wilson JR, et al. Вакцинация против гриппа ускоряет выздоровление хорьков от лимфопении. PLoS One (2014) 9:e100926. doi: 10.1371/journal.pone.0100926

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

70. DiPiazza AT, Richards KA, Liu WC, Albrecht RA, Sant AJ.Анализы клеточного иммунного ответа у хорьков после заражения вирусом гриппа. Methods Mol Biol (Клифтон, штат Нью-Джерси) (2018) 1836:513–30. doi: 10.1007/978-1-4939-8678-1_24

Полный текст CrossRef | Google Scholar

71. Martel CJ-M, Aasted B. Характеристика антител против иммуноглобулинов хорька, цитокинов и маркеров CD. Veterinary Immunol Immunopathol (2009) 132:109–15. doi: 10.1016/j.vetimm.2009.05.011

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ferrets Care and Vaccines in Waukesha, WI

Медицинский осмотр : всем хорькам в возрасте до 4 лет рекомендуется проходить ежегодный осмотр.После 4 лет мы рекомендуем ежегодно проходить медицинский осмотр.

Прививки: Хорьки должны быть вакцинированы против вируса чумы хорьков и бешенства. Начальной серией для молодых хорьков является вакцина Purevax Ferret Distemper Vaccine в возрасте 8, 12 и 16 недель, затем ежегодно; Бешенство в 16 недель, затем ежегодно.

Диета:  Подрастающих хорьков следует кормить кормом для котят высшего качества или кормом для хорьков. Взрослых хорьков можно кормить премиальными кормами для взрослых кошек или хорьков, в зависимости от их веса.Допустимы небольшие количества свежих фруктов, овощей, хлеба или лакомств, но они не должны превышать 10% от общего рациона.

Борьба с паразитами:  Проверка фекальных паразитов должна проводиться у всех новых хорьков, а также у всех хорьков с желудочно-кишечными заболеваниями или необъяснимой потерей веса. Хорьки очень восприимчивы к сердечным червям, и один червь может привести к летальному исходу из-за небольшого размера сердца хорька. Рекомендуется профилактика сердечного червя. Мы используем feline Heartgard для хорьков с апреля по декабрь каждого года; в тесте нет необходимости, так как ни один доступный тест не является надежным для хорьков.

Жилье:  Хорьков следует изолировать, если они не находятся под непосредственным надзором, поскольку они легко ввязываются во всевозможные неприятности. Они легко, случайно теряются, возводятся в квадрат, запираются в комнатах или чуланах; и будут пытаться съесть все, что поместится в их рты. Уместны многоуровневые клетки с возможностью тренироваться, зарываться, есть и пить. Клетка должна иметь сплошное дно (не проволочное) и быть достаточно большой, чтобы вместить лоток.

Общие проблемы:

Диарея:  Хорьки очень склонны к желудочно-кишечным расстройствам, поэтому следите за своим питомцем на наличие жидких фекалий.Поскольку хорьки маленькие, они легко обезвоживаются, поэтому любые проблемы с диареей следует решать как можно скорее.

Инородные тела кишечника:  Поскольку хорьки любят все грызть, у молодых хорьков часто возникает непроходимость кишечника из-за инородного тела кишечника. Вот почему очень важно убрать любые мелкие или съедобные предметы из среды, в которой живут хорьки.

Паразиты: Подобно собакам и кошкам, хорьки могут заражаться различными внешними и внутренними паразитами. Ваш хорек должен осматриваться не реже одного раза в год одним из наших ветеринаров; вы также должны предоставить образец стула во время вашего первичного осмотра, чтобы его можно было проверить на наличие внутренних паразитов.

Опухоли или рак:  У хорьков сравнительно быстро развивается рак; раннее обнаружение очень важно для выживания, это еще одна причина, по которой так важен ежегодный осмотр у одного из наших ветеринаров. Хорьки склонны к раковым заболеваниям, таким как инсулинома (рак поджелудочной железы), опухоли надпочечников, крупноклеточные опухоли кожи и лимфосаркома (рак лимфатических узлов и лимфатических лейкоцитов).

Болезни сердца:  К сожалению, у хорьков часто развиваются болезни сердца из-за кардиомиопатии, которая обычно возникает в возрасте старше 3 лет. Клинические признаки болезни сердца включают слабость или вялость, потерю координации, анорексию, кашель и вздутие живота.

Обогащенные игрушки для вашего хорька:

    • Сушилка Шланг
    • Пустые бумажные пакеты
    • Соломенные коврики и корзины
    • Пищевые угощения в пластиковой бутылке или яичкоугольниках
    • Телефонные книги
    • Туалетная бумага / бумажные полотенце
    • Шарики для пинг-понга в воде
    • Прячущиеся игрушки в песочнице
    • Подвешенный мячик для пинг-понга, пластиковый мяч или веревка
    • Бумажный пакет, наполненный мятой бумагой
    • Картонная коробка, наполненная землей, рисом, мячиками для пинг-понга, сеном или скомканными кусочками бумаги

    Живая аттенуированная гриппозная вакцина снижает тяжесть гетеросубтипического вируса гриппа у хорьков

    Вирусы и клетки Центры по контролю и профилактике заболеваний (CDC, Атланта, США) и Национальный институт биологических стандартов и контроля (NIBSC, Potters Bar, Великобритания) соответственно).

    Моновалентная ЖГВ h2N1, содержащая гены HA и NA из A/California/07/09, была предоставлена ​​компанией AstraZeneca, Ливерпуль, Великобритания. ЖГВ A/CA09 размножали в аллантоисной полости 10–11-дневных куриных яиц с эмбрионами (Charles River Laboratories, Уилмингтон, Массачусетс, США). Шесть внутренних генных сегментов (PB2, PB1, PA, NP, M и NS) были предоставлены адаптированными к холоду, чувствительными к температуре A/Ann Arbor/6/1960 34 . Гены HA и NA были получены от дикого типа A/California/07/2009 35 .

    Вирусы титровали в клетках Madin-Darby Canine Kidney (MDCK), полученных из Европейской коллекции клеточных культур (ECACC, Портон-Даун, Великобритания).Титры вирусов определяли с помощью анализа бляшек на клетках MDCK под слоем агара, содержащего 1,8 мкг/мл TPCK-трипсина (Merck Life Science, Великобритания), с последующим окрашиванием кристаллическим фиолетовым (вирусы дикого типа) или иммуноокрашиванием NP. -специфическое моноклональное антитело 36 к ЖГВ. Анализы бляшек LAIV инкубировали при 33°C в течение 3 дней перед окрашиванием NP-специфическим антителом с последующим окрашиванием против мышиной щелочной фосфатазы и реагентом BCIP-NBT Plus (Mabtech, Nacka, Швеция).

    Животные

    Двадцать четыре самки хорьков ( Mustela putorius furo ) были получены из Highgate Farm, Великобритания, и перед началом экспериментов было подтверждено, что они являются серонегативными в отношении антител к гриппу h2N1pdm09, h4N2 и гриппу B с помощью анализа ингибирования гемагглютинации (HAI).Средний вес при вакцинации составлял ~960 г. Идентификационный чип (Bio-Thermo Identichip, Animalcare Ltd, Великобритания) вводили подкожно в дорсальную шейную область каждого животного. Животных контролировали на наличие признаков заболевания (чихание, выделения из носа, вялость) два раза в день (с интервалом ~ 8 часов) и ежедневно регистрировали вес. Температуру контролировали два раза в день с помощью чипа, увеличивая до семи раз в день в течение 3 дней после инокуляции контрольного вируса, чтобы гарантировать регистрацию любого пика лихорадки. Животным вводили внутримышечную инъекцию кетамина/ксилазина (17,9 и 3,6 мг/кг массы тела) перед интраназальным введением контрольного вируса (всего 0,2 мл, 0,1 мл на ноздрю), разведенного в фосфатно-солевом буфере (PBS). Вакцинация включала 0,2 мл ЖГВ, содержащих 10 7 БОЕ вируса. Назальные смывы получали с использованием 2 мл PBS. Экспериментальная работа с животными, описанная здесь, была тщательно изучена и одобрена Органом по благополучию животных и этике общественного здравоохранения Англии (Портон) в соответствии с требованиями Закона Министерства внутренних дел Великобритании о животных (научные процедуры) 1986 года.Помещения, в которых велись работы, одобрены сертификатом Home Office of Designation PCD70/1707. Все методы с участием хорьков были выполнены в соответствии с соответствующими руководящими принципами и правилами.

    Сывороточное антитело

    Образцы сыворотки титровали с помощью анализа HAI с использованием 4 единиц HA на лунку соответствующего вируса с последующим добавлением 0,5 % об. /об. эритроцитов курицы. Отобранные сыворотки также титровали методом микронейтрализации на клетках MDCK 14 .Вкратце, вирус и сыворотку инкубировали вместе в течение 2 ч при 37°С, затем смешивали с клетками MDCK в титрационном микропланшете. Через 18–20 ч клетки фиксировали и окрашивали мышиными антителами против NP, а затем конъюгатом козьих антимышиных пероксидаз хрена и субстратом о-фенилендиамина.

    Выделение РВМС и мононуклеарных клеток легких

    Лейкоцитарные пленки, содержащие лимфоциты, были приготовлены из свежей антикоагулированной крови с гепарином путем разделения по плотности на Histopaque 1083 18 .Клетки собирали центрифугированием и повторно суспендировали в соответствующем объеме криосреды (90% фетальной телячьей сыворотки, 10% ДМСО), что позволяло хранить клетки в жидком азоте аликвотами по 1 мл при концентрации 3 × 10 6 до 1,3 × 10 7 клеток/мл. Рассеченные легкие были диссоциированы с использованием диссоциатора тканей softMACS (Miltenyi Biotec, UK) 18 . Тканевую суспензию пропускали через два клеточных сита (100 мкм, затем 70 мкм), а мононуклеарные клетки очищали и замораживали, как описано выше для РВМС.Эритроциты удаляли из препаратов РВМС и легочных МНК с помощью 5 мин инкубации в лизирующем буфере ACK (Gibco, ThermoFisher Scientific, Великобритания).

    Подсчет жизнеспособных клеток

    Жизнеспособные клетки в смывах из носа, РВМС и МНК легких подсчитывали с использованием NucleoCounter®NC-200 (ChemoMetec, Allerod, Дания). Суспензии клеток загружали в кассеты Via-1, в которых использовались красители акридинового оранжевого и DAPI для окрашивания живых/мертвых клеток в соответствии с инструкциями производителя.

    Анализ интерферона-гамма (IFN-γ) ELISpot

    MNC легких оценивали на предмет ответа на A/California/07/2009 (h2N1) и A/Perth/16/2009 (h4N2) 18 .Оба вируса использовали при множественности заражений 0,08. После стимуляции в течение ночи клетки, экспрессирующие IFN-γ, выявляли с использованием набора Ferret интерферон-гамма ELISpot с предварительно покрытыми планшетами (Mabtech, Nacka, Швеция). Результаты повторных испытаний усреднялись. Данные анализировали путем вычитания среднего числа пятен в контрольных лунках (клетки и аллантоисная жидкость) из среднего числа пятен в лунках с клетками и антигеном.

    Ферретный иммуноферментный анализ IFN-γ (ИФА)

    Гепаринизированную цельную кровь разводили 1:10 бессывороточной средой RPMI 1640 и инкубировали либо с A/California/07/2009 (h2N1), либо с A/Perth/ 16/2009 (h4N2) аллантоисные жидкости (1.6 × 10 6 БОЕ). Фитогемагглютинин PHA-M (Sigma-Aldrich, Дорсет, Великобритания) использовали в качестве положительного контроля, а яичную аллантоисную жидкость использовали в качестве отрицательного контроля. Кровь стимулировали в течение 4 дней при 37°С, после чего собирали супернатанты плазмы и криоконсервировали при -80°С. Набор Ferret IFN-γ ELISA Development Kit (ALP) (Mabtech, Nacka, Sweden) использовали для определения количества IFN-γ, секретируемого клетками в крови, как описано 18 .

    Статистический анализ

    Статистический анализ проводили с помощью GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, La Jolla, CA).

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.