Перейти к содержимому

Диатез у собак чем лечить: Пищевая аллергия и аллергия на компоненты окружающей среды у собак

Содержание

причины и советы по лечению

Содержание:

Аллергия – болезнь, которая может возникнуть у любой кошки, независимо от ее возраста и породы. Это опасное заболевание, которое не поддается лечению. 

Задача владельца – вовремя диагностировать аллергию, облегчить состояние питомца и постараться предотвратить ее рецидивы.

Что такое аллергия?

Аллергия – это специфическая реакция иммунной системы на воздействие вещества, вызывающего ее – аллергена. Эти компоненты могут проникать в организм снаружи или образовываться внутри него из-за наличия какой-либо патологии. 


Иммунитет пытается справиться с аллергенами самостоятельно. Как только они попадают в организм, иммунная система “изучает” их и пытается создать антитела для устранения – иммуноглобулины. Они соединяются с базофилами и “считывают” строение аллергена. При повторном попадании его в организм выделяется гистамин.

Именно он вызывает реакцию организма, которую мы называем аллергией.

Аллергенами могут служить самые разные вещества, среди которых:

  • продукты питания;
  • бытовая химия;
  • пыль;
  • плесень;
  • пыльца растений;
  • продукты жизнедеятельности паразитов – глистов и блох;
  • шерсть других питомцев.

Симптомы аллергии

При аллергии у кошек наблюдается симптоматика, включающая в себя следующие признаки:

  • сильный зуд;
  • шелушение кожи;
  • экземы;
  • выпадение шерсти;
  • наличие облысевших участков на теле;
  • выделения из носа и глаз;
  • отечность век;
  • “корочки” во внутренних уголках глаз;
  • гипертермия;
  • частое дыхание;
  • кашель;
  • чихание;
  • нарушения дефекации и мочеиспускания;
  • повышенная потливость;
  • неприятный запах из пасти;
  • отечность.

На аллергию указывает наличие одного или нескольких симптомов.  В тяжелых случаях возникают более серьезные симптомы – анафилактический шок и отек Квинке. У животного наблюдаются:

  • отеки на коже;
  • падение артериального давления;
  • затрудненное дыхание;
  • бледность или синюшность слизистых оболочек;
  • потеря сознания.

Это очень опасное состояние, и в случае несвоевременно оказанной помощи может привести к летальному исходу.

Виды аллергии


Пищевая аллергия


Возникает при попадании в организм продукта питания, который является аллергеном.

Симптомы:

  • сильный зуд;
  • сыпь на коже;
  • нарушения работы желудочно-кишечного тракта – рвота, понос;
  • выделения из глаз и носа;
  • выпадение шерсти;
  • заложенность носа.

Чаще всего у кошек развивается пищевая аллергия, если она питается натуральной едой. Самые популярные аллергены – баранина, курица, молоко, яйца, соя, злаки. 

Готовые сухие и влажные корма разрабатываются с учетом риска развития пищевой аллергии. Если у питомца наблюдается реакция на какой-либо вид мяса, рекомендуется заменить привычный корм на рацион с другим источником белка. Однако чаще в роли аллергенов выступают злаки, поэтому следует выбирать для кошек беззерновые или низкозерновые корма классов холистик, супер-премиум и премиум.



описание болезни, симптомы, диагностика, лечение

Справочная информация о болезни Кровоточивость множественная (Геморрагический диатез) (собаки): описание, симптомы, признаки, диагностика, лечение домашних животных

Вид животного:

Собаки

Описание болезни:

Это группа различных заболеваний, отличительным признаком которых является повышенная кровоточивость.

Причины развития болезни

Наследственные дефекты системы свертывания крови, аллергические и аутоиммунные состояния, гиповитаминозы С и К, инфекционные болезни, микотоксикозы.

Симптомы болезни

Множественные кровоизлияния в коже, слизистых оболочках. Спонтанные кровотечения или под влиянием незначительных травм. Длительные кровотечения из слизистых оболочек носа, ротовой полости, влагалища, желудочно-кишечного тракта, других органов. Постгеморрагическая анемия.

Диагностика болезни

Для постановки диагноза необходимо провести минимальные лабораторные исследования, а именно: общий анализ крови, морфологию эритроцитов, тромбоцитов; анализ мочи и кала на наличие крови, определение белка плазмы, мочевины, креатинина в сыворотке, билирубина и ферментов печени. Возможно, потребуется рентгеновское или ультразвуковое исследование, чтобы диагностировать внутреннее кровотечение. Кровотечение в суставы и другие полости тела можно диагностировать посредством жидкостной цитологии.

Лечение болезни

Устраняют причины болезни, назначают диетотерапию, при гиповитаминозных состояниях — витаминотерапию. При аутоиммунных состояниях показаны кортикоетероидные препараты, гемотерапия.

Болезни по видам животных

Впечатляющее видео

В 2 года родители купили малышу баскетбольное кольцо и мяч, посмотрите, что умеет этот малыш в 5 лет!


Нужны деньги до зарплаты?

более 30 сервисов

Кредиты онлайн на карту за 15 минут

до 180 дней

макс срок

до 20 000 грн.

макс сумма




Аллергия у Лабрадоров: симптомы и лечение

Аллергия у собак лабрадоров – довольно распространённый недуг, который может сохраниться на всю жизнь. При правильном подходе к лечению и соблюдении всех рекомендаций ветеринара, недуг можно поддерживать в постоянной фазе ремиссии и заболевание не будет мешать питомцу вести привычный образ жизни.

Разновидности аллергических реакций

Аллергией называют ответную реакцию организма собаки на внешний раздражитель. Этим недугом обычно страдают молодые собаки, но патология может проявиться в любом возрасте.

Поэтому аллергия у лабрадора, а также симптомы и лечение этого заболевания требуют детального рассмотрения.

Различается заболевание по типу аллергена, спровоцировавшего развитие заболевания. У лабрадоров ретриверов, аллергия бывает 4-х типов:

  • Сезонная. Проявляется обычно в весенне-летний период, когда активно цветут растения. Некоторые собаки болезненно реагируют даже на комнатные цветы и растения.
  • Пищевая. Это самая распространённая аллергическая реакция, встречающаяся у лабрадоров. Причиной является некачественное и несбалансированное питание, в некоторых случаях, болезнь начинает развиваться после смены привычного рациона. Прогрессирует недуг очень быстро и имеет выраженную симптоматику: расстройство кишечника, рвота. Вызывает аллергию обычно молочная продукция, готовые корма, содержащие в составе ароматизаторы.
  • Контактная. Здесь причиной является непосредственный контакт животного с аллергеном. Возбудителем реакции могут являться шампуни, мебель, игрушки.
  • Лекарственная. Это ответная реакция организма собаки на медицинские препараты, поэтому недуг считается побочным эффектом перенесённого заболевания.
  • Помимо этого, спровоцировать аллергическую реакцию у лабрадора могут паразиты: кожные и внутренние.

 

Лучшая подборка для вашего питомца:

Можно выбрать только один параметр:

Все Гипоаллергенный Для кожи и шерсти Шампунь Таблетки АгроВетЗащита ТМ "ВАКА" Beaphar Для собак x Очистить

Аллергия у той терьера, что делать, какая бывает, чем лечить

Поскольку вы являетесь владельцем самой лучшей собаки на свете, то и уход за ней должен быть соответственный. Миниатюрность породы влечет за собой хлопоты в содержании и, к сожалению, проблемы со здоровьем. Самое частое встречающееся заболевание – это аллергия у той терьера.

Аномальная реакция организма на чужеродные вещества, все больше проявляющаяся у людей, свойственна и той терьерам.

Виды аллергии у той-терьеров.

Собачья непереносимость классифицируется в зависимости от типа этих чужеродных веществ.

  • пищевая. Такой вид заболевания могут провоцировать продукты, входящие в рацион собачки. Это пищевой белок, который есть в мясе птицы, яйцах, рыбе и рыбьем жире, молоке и молокосодержащих продуктах, дрожжах, овощах, цитрусовых, растительных маслах и фруктах красного цвета.

Лучше кормить тойчиков хорошим кормом, чтобы обезопасить собаку от пищевых расстройств,  а себя от нервов. В специализированных магазинах Вы можете приобрести  корм для собак JOSERA — в нем нету ненатуральных и генно-модифицированных составляющих, а песикам он очень по душе.

  • лекарственная. Применение антибиотиков при лечении заболеваний вызывает «неправильную» реакцию собачьего организма на препараты. Сульфаниламиды, живые вакцины и сыворотки, новокаин, амидопирин (пирамидон), хлоралгидрат, являются мощными катализаторами, вызывающими реакцию организма. К сожалению, и витамины группы В (дрожжи пивные и В1) способны вызвать подобную неправильную реакцию.
  • химическая. Бытовая химия и собачья косметика, которую многие хозяева так нещадно используют для питомца, пожалуй, наимощнейшие аллергены.
  • индивидуальная непереносимость аллергенов, таких как шерсть и перхоть животных, с которыми контактирует тойчик. А в некоторых случаях даже реакция на собственную линьку.
  • укусы. Чаще всего организм реагирует на укусы паразитических насекомых, таких как блоха, клещ, пчела, оса, шмель, и реже – на комаров.
  • инфекционная. Спровоцировать ненормальную болезненную реакцию организма могут бактерии, вирусы, грибки и, конечно же, глисты.

Неприятность заключается в том, что маленького той терьера аллергия может настигнуть в любой момент. Причем проявиться она может как мгновенно (буквально через несколько минут), так и в процессе накопления аллергена в организме (дней через десять, а то и больше).

Аллергия у той терьера. Симптомы.

Рассмотрим наиболее частые виды аллергии у той терьера и симптомы, позволяющие своевременно выявить заболевание. Для наглядности представим фото симптомов аллергии у той терьера.

  • той терьер начинает лизать лапки, тереться мордочкой и боками о ковер, покусывать себя, хотя блох нет. Таким образом песик хочет унять зуд тела, донимающий его. Эти признаки свидетельствуют о развитии сенной лихорадки.

Такой реакции подвергаются чувствительные особи (а той терьеры практически все такие) декоративной породы. Через органы дыхания в организм попадает пыльца растений, пыль, мелкие перышки и перхоть. Все это вызывает неимоверный зуд, который наиболее проявляется в нежных частях тела терьерчика – в паховой области, подмышками и у основания хвостика. На фоне аллергии, вызванной сенной лихорадкой, у той терьера, могут начать развиваться заболевания ушек и появиться перхоть. Точный диагноз установит ветеринар, который проведет анализ крови и исследует шерсть собачки.

  • на участках тела, которые наименее покрыты шерстью (мордочка, грудь, животик) появляются покраснения кожи. Такой вид заболевания вызван непосредственным контактом с агрессивными химическими средствами (шампунь, капли, спреи, ошейники от блох, бытовая химия).
  • на кожном покрове той терьера появляются бугорки и нарывы, постепенно преобразующиеся в язвочки и гнойники. Наиболее уязвимыми оказываются голова и спина той терьера. Засыхая, гнойники превращаются в коросту, которая отшелушиваясь, отпадает вместе с шерстью. На тельце собачки после этого остаются красные проплешины. Такая реакция (пиодерма) проявляется на бактерии рода Staphylococcus medius. Данные бактерии являются причиной воспаления волосяной луковицы у животного.
  • зуд, вызванный укусами блох, чаще всего проявляется на фоне аллергии на пищу или сенной лихорадки. Декоративные собачки, искусанные блохами, начинают кусать свои бока и хвостик, теряют шерсть.
  • собачки вычищают и лечат сами себя, вылизывая свою шерсть и кожный покров. Но, как только вы заметите, что той терьер буквально зализывает себя в одном и том же месте, бейте тревогу. У тоя – дерматит. На зализанном участке тела в скором времени появятся воспаление или язвы. Причины возникновения дерматитов у собак еще до конца не изучены. Ветеринары склонны к тому, что дерматит – это следствие неврозов у животного, а иногда и обычная скука.
  • наиболее трудно диагностировать пищевую аллергию. Дело все в том, что ее симптомы иногда схожи с обычной непереносимостью продуктов, но это только по внешнему виду.

Если копнуть гораздо глубже, то пищевая непереносимость – всего лишь внешний проявитель, а пищевая аллергия оказывает негативное разрушающее воздействие на иммунную систему животного. Выражается аллергия на продукты по-разному. Собака может тяжело дышать, на коже могут быть покраснения и признаки зуда и сыпи. Из глаз и носа часто бывают выделения без видимых на то причин. Той терьер может начать часто ходить в туалет по-маленькому и по-большому. При осмотре ротовой полости, можно наблюдать синюшный оттенок десен. А если реакция организма на какой-либо продукт протекает давно или же остро выражена, то слизистые начинают отекать. Крайнее проявление аллергии сопровождается анафилактическим шоком, судорогами, трудностями с дыханием, которое может вылиться в острую форму удушья. Что впоследствии (причем недалеком, если не обратиться к ветеринару) приведет к прекращению дыхания и остановке деятельности сердца у той терьера.

Аллергия у той терьера. Лечение.

Но не все так печально. Ваша задача своевременно выявить симптомы аллергии у той терьера. Лечение оставьте за ветеринаром. Только собачий доктор разберется и найдет причину такой своеобразной реакции организма, взяв пробы на лабораторные анализы и тесты.

В принципе, как и для людей, помощниками в лечении аллергических проявлений у собачек, есть антигистаминные препараты и устранение источника аллергий.

  • антигистаминные лекарства облегчают состояние той терьера при сенной лихорадке. От вас требуется проводить ежедневную влажную уборку в помещении и в период цветения уличных растений, ограничить продолжительность прогулок.

Совет

не занимайтесь самолечением той терьера. Препараты и дозировку должен назначать ветеринар.

  • при контактной аллергии – временно прекратите использовать в быту химические средства для уборки, не купайте собаку со специальными средствами и замените противоблошиный ошейник. Снять зуд у той терьера помогу гипоаллергенные препараты, такие как мази-кортикостероиды.
  • лечение пиодермы требует установки точного диагноза. Только тогда можно применять бактерицидные шампуни и, увы, не обойтись без антибиотиков.
  • реакцию на укусы блох можно уменьшить с помощью антигистаминных препаратов. Но параллельно уничтожьте паразитов в доме.
  • при дерматитах нет единого подхода в лечении. Средства подбираются с учетом индивидуальной переносимости. Общие рекомендации сводятся к применению противовоспалительных мазей, лучевой терапии. В особо тяжелых случаях, чтобы той терьер не продолжал вылизывать себя до ран, на питомца надевают «елизаветинский воротник». Антидепрессанты и транквилизаторы подбирают очень осторожно.
  • пока ветеринар определяет пищевой аллерген, вызвавший негативную реакцию, переведите той терьера на гипоаллергенный рацион, который включает в себя баранину и рис. Вода для питья должна быть или дистиллированная или кипяченая. Никаких кормлений со стола, витамин и минерально-витаминных подкормок.

Когда исчезнут явные признаки аллергии, начинайте вводить в меню по одному компоненту (вначале одно из растительных масел, затем что-то из овощей и т.д.).

И еще, пусть у вас под руками будет памятка о первой помощи при острой аллергической реакции:

  • Вызываем ветеринара.
  • Исключаем воздействие аллергена (если он явный и это представляется возможным).
  • Вводим внутримышечно супрастин (можно заменить любым антигистаминным препаратом).
  • При остановке сердца и прекращении дыхания, до приезда ветеринара делаем непрямой массаж сердца.
  • В случае рвоты, помогаем собаке, очищая ротовую полость от рвотных масс.
  • Придаем питомцу удобную позу, которая даст свободный доступ кислороду.
  • Если у вашего друга анафилактический шок, делаем инъекцию дексаметазона, дексона или гидрокортизона. По истечению пятнадцати минут, если состояние тоя не улучшилось, повторно вводим антигистаминное средство.
  • Будем надеяться, что данная памятка никогда вам не понадобится. Здоровье той терьера должно быть постоянно под вашим контролем.

    Аллергия у собак — лечение в ветеринарной клинике в Санкт-Петербурге

    Аллергия у собак это реакция иммунной системы на определенный фактор, который в норме не вызывает никаких болезненных проявлений. Если вам кажется, что у Вашей собаки есть аллергическая реакция, очень важно, как можно скорее показать ее ветеринарному дерматологу.  Далеко не всегда чтобы вылечить аллергию у собаки,  нужно сразу же прибегать к антигистаминным препаратам, гормонам, антибиотикам, или иным препаратам.

    Лечение симптомов, без поиска источника проблемы, может дать лишь временный краткосрочный эффект, а в долгосрочной перспективе это может оказаться пожизненная клиническая проблема для вашего питомца.

    Кроме того, некоторые  препараты, которые лечат симптомы аллергии,  потенциально имеют очень серьезные побочные эффекты.

    Аллергия на блох

    Аллергический дерматит связан в большинстве случаев с укусами блох, так как в слюне блох содержатся вещества которые могут оказывать аллергизирующее действие. Собака с гиперчувствительной кожей уже после одного укуса начнет сильно чесаться.

    Советы по уходу за собакой для предотвращения блошиных аллергий

    Крайне желательно проводить специальные обработки против блох, для этого могут быть использованы таблетки, капли на кожу. Также очень важно проводить обработку внешней среды. Для того, чтобы делать это правильно, желательно получить консультацию у врача – дерматолога.

    Пищевая аллергия

    Если у Вашей собаки есть пищевая аллергия/непереносимость она может проявляться не только посредством пищеварительных расстройство (диарея, рвота), но также проявляться дерматитами, отитами, воспалением кожи между пальцев, и иногда – ринитами и конъюнктивитами.

    Если Вы подозреваете, что у Вашей собаки аллергическая реакция на какой-то продукт из её рациона, то лучше обратиться к ветеринарному дерматологу для проведения специальной диеты, которая сможет позволить исключить или подтвердить наличие пищевой аллергии.

    Экологические аллергии

    У Вашей собаки может быть аллергия на различные раздражители окружающей среды. Это могут быть внешние аллергены такие как  пыльца различных  трав,  кустарников,  деревьев.  Также (наиболее часто) аллергии вызываются  воздействием таких аллергенов, как клещи бытовой пыли и плесневые грибы.

    Для выявления этих аллергенов используются или внутрикожные тесты, или исследование крови. Это важно для подбора аллергенов для специальной вакцинации. Этот метод лечения – вакцинации аллергенами – единственный способ дать шанс вашей собаке навсегда избавиться от аллергии на экологические факторы.

    На нашей страничке мы постарались немного приоткрыть некоторые тонкости диагностики и лечения аллергии у собак.

    Кровотечения у собак - Владельцы собак

    В процессе свертывания крови участвует множество различных белков. Дефицит любого из этих белков может вызвать нарушение свертываемости крови. Врожденные нарушения белков свертывания крови присутствуют при рождении. При тяжелом дефиците или дефекте белков свертывания признаки появляются в раннем возрасте. Серьезные дефекты обычно смертельны. Животные могут рождаться мертвыми или умирать вскоре после рождения. Недостаток белков свертывания крови или витамина К (который также является частью процесса свертывания крови) у новорожденного животного может усугубить дефект свертывания крови. Если количество какого-либо конкретного белка свертывания крови составляет от 5 до 10% от нормы, новорожденный может выжить, но обычно у него появляются признаки болезни до 6-месячного возраста. Именно в это время, когда обычно проводятся многочисленные рутинные процедуры (например, вакцинация, удаление прибылых пальцев, кастрация или удаление яичников), ваш ветеринар может заметить тенденцию к кровотечению. Большинство нарушений белков свертывания, присутствующих при рождении у домашних животных, являются дефектами одного белка.

    Гипофибриногенемия (аномальная нехватка фибриногена в крови), сопровождающаяся сильным кровотечением, зарегистрирована у сенбернаров и выжласов. Дисфибриногенемия (аномально функционирующий фибриноген) зарегистрирована в инбредной семье русских волкодавов (борзых). У собак с расстройством были легкие проблемы с кровотечением (например, кровотечение из носа), но травма или хирургическое вмешательство приводили к опасному для жизни кровотечению. Внутривенное переливание свежей или свежезамороженной плазмы (жидкой части крови) является лучшим средством для остановки кровотечения.

    Фактор II (протромбиновый) нарушения встречаются редко. Протромбин является одним из белков, играющих роль в свертывании крови.Сообщалось, что у собак-боксеров протромбин присутствует в организме в нормальных количествах, но не функционирует нормально. Сообщалось о нарушении фактора II у английских кокер-спаниелей. Признаки у пораженных щенков, такие как кровотечение из носа и кровоточивость десен, уменьшаются с возрастом. У взрослых легко появляются синяки или воспаляется кожа. Лечение заключается в переливании цельной крови или плазмы.

    Дефицит фактора VII , другого белка свертывания крови, был зарегистрирован у биглей, английских бульдогов, аляскинских маламутов, аляскинских кли-каев, цвергшнауцеров, боксеров и собак смешанных пород.Обычно это не связано с внезапным необъяснимым кровотечением, но у пострадавших собак могут быть синяки или сильное кровотечение после операции. Сообщалось о длительном кровотечении после родов. Дефицит фактора VII чаще всего диагностируется случайно при проведении тестов на свертываемость крови.

    Гемофилия А (дефицит фактора VIII) является наиболее распространенным наследственным нарушением свертываемости крови у собак. Обычно самки несут ген заболевания без каких-либо признаков, в то время как самцы проявляют признаки.У больных щенков наблюдаются длительные кровотечения из пуповины после рождения, из десен во время прорезывания зубов и после операции. Хромота из-за кровотечения в сустав, внезапное образование тромба и просачивание крови в полость тела также являются частыми признаками у собак с менее чем 5% нормальной активности фактора VIII. Животные с активностью от 5 до 10% от нормальной обычно не имеют спонтанных кровотечений, но кровоточат чаще, чем обычно, после травмы или хирургического вмешательства. Маленькие собаки с меньшей вероятностью проявляют признаки болезни.Животные-носители имеют более высокие уровни фактора VIII (от 40 до 60% от нормы), и результаты их тестов на свертываемость обычно в норме. Диагноз труднее подтвердить у животных в возрасте до 6 месяцев, поскольку их печень может еще не вырабатывать достаточное количество белков свертывания крови. Лечение требует повторных переливаний цельной крови или плазмы до тех пор, пока кровотечение не будет остановлено.

    Гемофилия B (дефицит фактора IX) встречается реже, чем гемофилия A. Сообщалось о нескольких породах чистопородных собак и собаке смешанной породы.Самки обычно являются носителями и редко имеют признаки заболевания. Признаки аналогичны симптомам гемофилии А. Животные с крайне низкой активностью фактора IX (менее 1% от нормы) обычно погибают при рождении или вскоре после этого. У животных с нормальной активностью фактора IX от 5 до 10% могут внезапно развиться тромбы, кровоизлияния в суставы, просачивание крови в полости тела или кровотечение из органов. Десны могут сильно кровоточить во время прорезывания зубов. У некоторых животных нет никаких признаков до травмы или операции. Животные-носители с активностью фактора IX от 40 до 60% от нормальной обычно не имеют признаков и нормальные результаты тестов на свертываемость крови. Лечение требует переливания свежей или свежезамороженной плазмы. Часто возникает внутреннее кровотечение в брюшную полость, грудную клетку, центральную нервную систему или мышцы, которое может оставаться незамеченным до наступления криза.

    Врожденные нарушения белков свертывания, связанные с дефицитом фактора X, фактора XI, фактора XII и прекалликреина, были зарегистрированы у нескольких собак, но, по-видимому, встречаются крайне редко. Наконец, плохая прочность сгустка вызвала кровотечение после операции у некоторых грейхаундов.

    Нарушения свертываемости крови у мелких животных

    Файл фактов

    У собак или кошек могут быть кровотечения или синяки, если есть проблемы с их функцией свертывания крови.

    Это может быть очевидно снаружи, например, по синякам на коже, носовым кровотечениям или крови в моче. Однако иногда у животных может быть внутреннее кровотечение, в грудную клетку или брюшную полость, в суставы или мозг или в кишечник (когда кровь может быть видна в рвотных массах или фекалиях, или фекалии могут быть темного или черного цвета).

    Во-первых, важно выяснить, есть ли местная проблема, вызывающая кровотечение, например, если присутствует опухоль или собака или кошка перенесли травму.Самый простой способ сделать это — поговорить с владельцем животного, провести тщательный медицинский осмотр, анализы крови, а затем, иногда, диагностическую визуализацию, такую ​​как рентгенография (рентген), УЗИ или компьютерная томография.

    Если клиницист решит, что имеется проблема со свертываемостью крови, то, вероятно, потребуются дополнительные анализы. Большинство проблем со свертываемостью крови связаны либо с тромбоцитами (фрагментами мелких клеток, запускающими процесс свертывания крови), либо с факторами свертывания крови (веществами в крови, которые стабилизируют первоначальный сгусток крови, образованный тромбоцитами).Иногда могут быть проблемы со слишком быстрым разрушением тромбов, но это бывает редко.

    Различные лекарства от разных причин

    Существует много возможных причин проблем со свертываемостью крови. У собак и кошек описано много наследственных проблем со свертываемостью крови, таких как гемофилия, но они встречаются очень редко. Наиболее распространенные проблемы с кровотечением, которые мы наблюдаем в RVC:

    • Иммуноопосредованная тромбоцитопения. Это заболевание, при котором иммунная система собаки или кошки разрушает собственные тромбоциты.Этих пациентов лечат иммунодепрессантами и переливаниями эритроцитарной массы.
    • Интоксикация родентицидами. Многие крысиные яды останавливают свертывание крови и действуют на собак и кошек так же, как и на крыс. Эти яды особенно вкусны для собак. Мы можем лечить этих животных витамином К, а иногда и переливаниями плазмы и эритроцитов.
    • Инфекция Angiostrongylus vasorum (легочный червь). Легочный червь может вызвать проблемы со свертываемостью крови, и мы не совсем понимаем, почему, хотя RVC проводит исследования в этой области, которые могут помочь нам найти более эффективные методы лечения.Пораженных собак лечат антипаразитарными препаратами и переливаниями плазмы.

    Важность доноров

    Переливание плазмы и эритроцитарной массы может быть очень полезным для лечения многих пациентов с проблемами свертывания крови. Мы всегда рады услышать от владельцев, которые думают, что их питомец может быть подходящим донором крови. Пожалуйста, посмотрите на наш веб-сайт здесь и дайте нам знать, может ли ваша кошка или собака стать героем, спасающим жизнь!

    Успешное лечение гемофилии собак путем непрерывной экспрессии собачьего FVIIa

    Abstract

    Непрерывная экспрессия активированного фактора VII (FVIIa) посредством переноса генов является потенциальным терапевтическим подходом для пациентов с гемофилией с наличием или отсутствием ингибирующих антител к человеческому фактору VIII (FVIII) или IX (ФИКС).Здесь мы исследуем, может ли перенос гена сконструированного трансгена собачьего FVIIa (cFVIIa) влиять на гемостаз в собачьей модели гемофилии, что является хорошим предиктором эффективности лечения гемофилии. Очищенный рекомбинантный cFVIIa проявлял в 12 раз более высокую активность, зависящую от тканевого фактора, чем очищенный рекомбинантный зимоген cFVII. Впоследствии мы создали рекомбинантный аденоассоциированный вирусный вектор серотипа 8, экспрессирующий cFVIIa из специфичного для печени промотора. Доставка вектора через воротную вену у собак с гемофилией А и В хорошо переносилась, а длительная экспрессия cFVIIa приводила к укорочению протромбинового времени, частичной коррекции времени свертывания цельной крови и параметров тромбоэластографии, полному отсутствию спонтанной эпизоды кровотечения.Признаков гепатотоксичности, тромботических осложнений или ингибирующего иммунного ответа обнаружено не было. Эти данные являются первыми доказательствами эффективности и безопасности in vivo непрерывно экспрессируемого FVIIa в качестве агента, обходящего FVIII/FIX, в модели гемофилии у крупных животных, что позволяет избежать риска образования ингибитора, связанного с болюсной инфузией FVIII или FIX.

    Введение

    Несмотря на доступность полученного из плазмы и рекомбинантного человеческого фактора VIII (rhFVIII) или фактора IX (rhFIX) в качестве терапевтических средств для лечения гемофилии, образование ингибиторов (20–30 % при тяжелой гемофилии А; ~ 5 % при тяжелой гемофилии B 1,2 ) остается серьезным осложнением у значительной части этих пациентов. Фармакологические дозы активированного рекомбинантного человеческого фактора VII (rhFVIIa), вводимые многократными дозами 3 или однократной высокой дозой 4 , успешно вызывали гемостаз у таких пациентов, а также у пациентов с нарушениями тромбоцитов 5 и дефицитом FVII. 6,7 Дозирование rhFVIIa также продемонстрировало эффективность при краткосрочной вторичной профилактике. 8 Однако необходимость повторных инъекций (ежедневное введение) из-за короткого периода полувыведения из плазмы может ограничивать его удобство для длительных периодов профилактики

    В попытке обойти эти недостатки мы ранее продемонстрировали, что трансген фактора VII разработанный для секреции в активированной форме (FVIIa), может корректировать параметры гемостаза в мышиных моделях гемофилии A (HA) и B (HB) либо после доставки аденоассоциированного вирусного (AAV) вектора 9 , либо у трансгенных животных. 10 Однако необходимым шагом, предшествующим применению у человека, является демонстрация безопасности и эффективности на модели крупного животного (собаки). Эта важная модель гемофилии очень напоминает человеческое заболевание с точки зрения размера, физиологии и генетических детерминант иммунного ответа, потому что она является аутбредной, а не инбредной. 11 Кроме того, он является хорошим предиктором эффективности лечения гемофилии. 12–15 Опосредованный вирусом перенос гена фактора VIII (FVIII) или фактора IX (FIX) в этой модели продемонстрировал, что антигенность трансгенного продукта остается проблемой 16,17 , поскольку эти животные могут быть не полностью толерантны к FVIII или FIX дикого типа.С другой стороны, непрерывная экспрессия мышиного FVIIa у иммунокомпетентных мышей с гемофилией после переноса гена не приводила к трансген-специфичному иммунному ответу, о чем свидетельствует долгосрочная экспрессия. 9 Таким образом, перенос гена FVIIa может не только влиять на гемостаз и обходить ингибитор (функциональное преимущество), но в то же время избегать трансген-специфического иммунного ответа, возникающего в результате толерантности к введенному трансгену (иммунологическое преимущество).

    Чтобы продемонстрировать, передается ли это преимущество беспородному крупному животному, мы использовали модель собачьей гемофилии и оценили основанную на генах AAV-опосредованную непрерывную экспрессию собачьего фактора VIIa (cFVIIa) в качестве средства для лечения гемофилии.Мы показываем долгосрочную эффективность с заметным улучшением геморрагического диатеза без признаков гепатотоксичности, тромботических осложнений или ингибирующего иммунного ответа на cFVIIa. Таким образом, наши результаты предоставляют первые доказательства эффективности и безопасности основанного на генах FVIII/FIX обходного агента FVIIa для лечения гемофилии на модели крупного животного. Эта стратегия также может применяться при нарушениях тромбоцитов, дефиците FVII или для профилактики врожденной гемофилии, осложненной развитием ингибиторов.

    Методы

    Конструирование плазмиды, очистка белков и производство AAV

    Плазмидный вектор на основе pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA), содержащий кДНК собачьего фактора VII (cFVII) 18 , использовали для получения cFVIIa с помощью полимеразной цепной реакции мутагенез (путем вставки последовательности Arg-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg [RKRRKR] в положение 152 в последовательности зрелого cFVII), как описано ранее. 9 Для очистки cFVII или cFVIIa к транслируемой пептидной последовательности добавляли метку С-концевого эпитопа (HPC4), как описано ранее, 9 , таким образом получая cFVII-HPC4 и cFVIIa-HPC4.Стабильные клеточные линии на основе клеток почки эмбриона человека (HEK-293) были созданы путем трансфекции и селекции в G418, а белки были очищены из кондиционированной среды с добавлением витамина К с использованием одноэтапной иммуноаффинной колонки (против эпитопа HPC4), как ранее. описано. 9 Концентрацию белка определяли спектрофотометрически с использованием молекулярной массы 50 000 и коэффициента экстинкции (E 280 0,1% ) 1,39. Плазмида AAV, используемая для векторной экспрессии cFVIIa (без метки HPC4) из специфичного для печени промотора (антитрипсин человека α 1 [hAAT]) и энхансера (4 копии энхансера аполипопротеина E [apoE]), как описано ранее. 9 Получение вектора AAV серотипа 8 осуществляли путем тройной трансфекции, по существу, как описано ранее. 9

    Анализы свертывания очищенных белков

    Анализы протромбинового времени (PT) с использованием очищенного рекомбинантного белка проводили в двух повторах с использованием фиброметра (STart Instrument; Diagnostica Stago, Parsippany, NJ) путем регистрации времени свертывания рекомбинантного белка (25 мкл в Трис-буферном солевом растворе [TBS]; 50 мМ Трис, 150 мМ NaCl, 0,1% бычий сывороточный альбумин, рН 7.5; TBS – бычий сывороточный альбумин [BSA]) с использованием равных объемов собачьей FVII-дефицитной плазмы 18 и, после инкубации при 37°C, 100 мкл релипидированного рекомбинантного человеческого тканевого фактора (TF; Innovin; Dade Behring, Deerfield, IL) как источник ТФ. Анализ активированного частичного тромбопластинового времени (аЧТВ) рекомбинантных белков проводили в двух повторностях путем разбавления рекомбинантного белка в общей сложности 25 мкл собачьей плазмы с дефицитом фактора VIII или собачьего фактора IX и добавления 1-в-4 разведения реагента аЧТВ (25 мкл общего объема в имидазоловом буфере; Biomrieux, Durham, NC). После инкубации при 37°C в течение 3 минут добавляли 25 мкл 25 мМ CaCl 2 и регистрировали время образования сгустка. Как для ПВ, так и для аЧТВ очищенные рекомбинантные белки сравнивали с использованием эталонной стандартной кривой rhFVIIa. В этих экспериментальных системах анализа нормализация ПВ плазмы собак с дефицитом FVII наблюдалась при использовании приблизительно 70 нг/мл cFVIIa и приблизительно 200 нг/мл rhFVIIa. Нормализация АЧТВ HA и HB наблюдалась при 20 мкг/мл как cFVIIa, так и rhFVIIa.

    Анализы на свертывание для экспериментов на мышах и собаках

    Анализы ПВ для образцов плазмы мышей или собак проводили путем регистрации времени до свертывания после смешивания 25 мкл образца (разбавленного в 40-кратном [собачьем] или 160-кратном [мышином] в TBS -BSA), 25 мкл человеческой FVII-дефицитной плазмы и, после инкубации при 37°C, добавление 100 мкл Innovin.Анализы аЧТВ для образцов плазмы мышей выполняли, как описано выше (см. «Анализ свертывания очищенных белков»), но с использованием неразбавленного реагента аЧТВ. Время свертывания цельной крови (WBCT) определяли по существу, как описано ранее. 16 Тромбоэластографию выполняли, как описано ранее 19 , с использованием свежезабранной крови и инициации коагуляции с помощью Innovin в разведении 1:200 000. Сравнение параметров тромбоэластографии между собаками, получавшими лечение AAV, и нормальными или нелечеными собаками с HA/HB было выполнено с использованием точек данных по крайней мере через 1 неделю после последней инфузии нормальной собачьей плазмы после переноса гена.

    Определение антигена cFVIIa

    Концентрацию экспрессированного cFVIIa в собачьей плазме определяли по активности свертывания с использованием набора STAclot (Diagnostica Stago), как описано ранее для rhFVIIa. 20 Вкратце, стандартная кривая увеличения концентрации cFVIIa (образец 50 мкл) в буфере для разбавления (50 мМ 1,4-пиперазиндиэтансульфокислоты, 100 мМ NaCl, 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты, 0,1% БСА, рН 7,2) была построена с использованием 50 мкл человеческой FVII-дефицитной плазмы и 50 мкл рекомбинантной растворимой смеси человеческого ТФ/фосфолипида. После 3-минутной инкубации при 37°C добавляли 50 мкл 25 мМ CaCl 2 и регистрировали время образования сгустка. Типичная стандартная кривая имела коэффициент корреляции (r 2 ) более 0,97 (log 10 [концентрация] против log 10 [время свертывания крови]). В этом анализе зимоген cFVII проявлял незначительную активность (примерно 3% относительно cFVIIa). Образцы цитратной плазмы обработанных, необработанных HA или HB или контрольных (нормальных) собак разводили в 10- или 50-кратном буфере для разведения и определяли время свертывания.Концентрацию cFVIIa в этих образцах рассчитывали по полученной стандартной кривой. Уровни собачьего FVIIa у нормальных, нелеченных собак с ГА или ГБ определяли с использованием не менее 4 отдельных образцов (в случае ГА или ГБ) или с использованием объединенного образца не менее чем от 4 собак (в случае нормальных собак).

    Анализ D-димера, фибриногена и тромбин-антитромбина

    Определение D-димера проводили в двух повторах в образцах цитратной плазмы собак с использованием набора Asserachrom D-Di на основе твердофазного иммуноферментного анализа (Diagnostica Stago). 21 Уровни фибриногена в образцах цитратной плазмы собак определяли в двух повторностях с использованием анализа на основе свертывания крови (метод Клаусса; Dade Behring), в котором в качестве эталона использовался стандарт плазмы человека. 21 Анализы проводились в соответствии с инструкциями производителя, но с использованием половины объема каждого реагента. Анализы тромбин-антитромбин (ТАТ) выполняли в двух повторностях на цитратной плазме с использованием микронабора Enzygnost TAT (Dade Behring). Уровни D-димера, фибриногена и ТАТ у нормальных, нелеченых собак с ГА или ГВ определяли с использованием не менее 4 отдельных образцов (при ГА или ГВ) или с использованием объединенного образца не менее чем от 4 собак (в случае нормальных собак).

    Введение вектора AAV мышам и собакам с гемофилией

    Все эксперименты на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Детской больницы Филадельфии и Университета Северной Каролины в Чапел-Хилл. Введение вектора мышам НА осуществляли в объеме 200 мкл (вектор в фосфатно-солевом буфере – 5% сорбита) через хвостовую вену. Образцы плазмы собирали в 3,8% цитрате путем разрезания хвоста. Инфузия вектора воротной вены, направленная на печень, у 3 HA (HA-1-J55, HA-2-J57 и HA-3-E66) и 1 HB (HB-1-J10) собак Университета Северной Каролины в Чапеле Хилл колонию выполняли, как описано ранее. 22 Антитела против AAV8 или cFVIIa были обнаружены с помощью твердофазного иммуноферментного анализа с использованием планшетов, покрытых либо AAV8, либо рекомбинантным cFVIIa, в основном, как описано ранее. 16 Химический состав сыворотки крови собак (гамма-глутамилтранспептидаза, аспартатаминотрансфераза, аланинаминотрансфераза, креатинфосфокиназа, щелочная фосфатаза, сывороточная глутаминовая пировиноградная трансаминаза, сывороточная глутаминовая щавелевоуксусная трансаминаза, общий билирубин и количество тромбоцитов) были проанализированы в автоматизированной лаборатории клинической патологии. Нормальный диапазон значений для каждого теста был получен у 18 клинически здоровых собак со смешанным генетическим фоном. Мониторинг проводили каждые 2 дня в течение первых 1-2 недель после введения AAV-cFVIIa, а затем каждые 1-3 месяца.

    Статистический анализ

    Для статистического анализа использовали непарный двусторонний критерий Стьюдента t или двусторонний точный критерий Фишера (для анализа эпизодов кровотечения), где P меньше 0,05, что указывает на статистическую значимость.

    Результаты

    Очистка рекомбинантных зимогенов cFVII и cFVIIa

    Первоначально мы создали стабильные клеточные линии на основе HEK-293, экспрессирующие зимоген cFVII или cFVIIa, оба белка содержат метку на С-концевом эпитопе (HPC4) для иммуноаффинной очистки (A) . 9 Рекомбинантные зимогены cFVII и cFVIIa были успешно выделены из кондиционированной среды с добавлением витамина К. В отличие от зимогена cFVII, который был очищен в одноцепочечной форме (что указывает на отсутствие аутоактивации во время очистки), cFVIIa был очищен почти исключительно в двухцепочечной, полностью активированной форме (В). Полосы с более низкой молекулярной массой, наблюдаемые при 10–16 кДа, вероятно, являются продуктами деградации, как ранее наблюдалось в препаратах рекомбинантного FVIIa человека. 23,24 Хотя тяжелые и легкие цепи cFVIIa по-разному окрашивались кумасси синим, это обычно обнаруживается в препаратах человеческого 23,24 , а также в препаратах мышиного FVIIa. 9,25

    Конструирование и характеристика in vitro собачьего FVII и собачьего FVIIa . (A) Конструкции собачьего FVII и FVIIa содержали метку С-концевого эпитопа (HPC4) для иммуноаффинной очистки.Для создания собачьего FVIIa мы ввели короткую аминокислотную последовательность (RKRRKR) в нормальный сайт расщепления собачьего FVII (Arg 152 -Ile 153 , указано), которая распознается внутриклеточной протеазой PACE/фуриновой тип. Расщепление этой последовательности (обозначенной ) приводит к секреции 2-цепочечной активированной молекулы. (B) Электрофорез зимогена (Z) cFVII и cFVIIa в полиакриламидном геле в восстанавливающих условиях. Указаны полосы маркера молекулярного размера (M) в кДа, а также тяжелые (~35 кДа, H) и легкие (~20 кДа, L) цепи.(C) ТФ-зависимая активность cFVII и cFVIIa в анализе свертывания на основе PT с использованием собачьей плазмы с дефицитом FVII по сравнению с rhFVIIa (100%). * P < 0,05 по сравнению с rhFVIIa. (D) Независимая от ТФ активность cFVII и cFVIIa в анализе свертывания крови на основе АЧТВ с использованием плазмы собачьей гемофилии A (HA) или B (HB) по сравнению с rhFVIIa (100%). ND указывает на необнаруживаемую активность.

    Активность зимогенов cFVII и cFVIIa in vitro

    Затем мы исследовали протеолитическую активность зимогенов cFVII и cFVIIa, используя rhFVIIa в качестве эталонного стандарта.Используя объединенную собачью плазму от собак с дефицитом FVII, 18 , мы определили TF-зависимую активность cFVIIa с использованием релипидированного рекомбинантного TF человека (Innovin). В этой системе зимоген cFVII проявлял очень низкую активность (~ 20% rhFVIIa, P < 0,001 по сравнению с rhFVIIa; C) в отличие от cFVIIa, который проявлял примерно 240% rhFVIIa ( P < 0,001 по сравнению с rhFVIIa; C), активность примерно в 12 раз выше, чем у зимогена cFVII. В независимом от ТФ анализе на основе АЧТВ с использованием HA или HB собачьей плазмы cFVIIa продемонстрировал незначительное увеличение (HA, P = .044) или сравнимой (HB, P = 0,44) активности по отношению к rhFVIIa (D). В этом анализе зимоген cFVII имел незначительную активность (D). Возможно, что несоответствие внешней и внутренней активности cFVIIa по сравнению с rhFVIIa является результатом использования релипидированного ТФ человека. В совокупности эти данные демонстрируют, что cFVII можно сконструировать таким образом, чтобы он секретировался в 2-цепочечной биологически активной форме.

    Эффективность AAV-опосредованного переноса гена cFVIIa у мышей и собак с гемофилией

    Мы создали вектор AAV серотипа 8 (AAV8-cFVIIa, A), управляющий экспрессией cFVIIa через специфичный для печени промотор, аналогично нашим предыдущим исследованиям на мышах. 9,10 Трансген cFVIIa в этом векторе AAV не содержал метки С-концевого эпитопа (HPC4). В предварительных экспериментах, предназначенных для проверки функциональности вектора AAV, мы проводили введение вектора в хвостовую вену мышам с гемофилией в дозе от 0,3 до 1,2E12 векторных геномов/мышь (1,2-4,8E13 векторных геномов/кг). После переноса гена экспрессия cFVIIa приводила к длительной межвидовой устойчивой гемостатической функции (B), о чем свидетельствует нормализация гемофильного аЧТВ ( P > .06 по сравнению с нормальными мышами, за исключением дня 42 [ P = 0,01]) и одновременного супрафизиологического укорочения PT ( P < 0,001 по сравнению с нормальными мышами). Таким образом, эти эксперименты подтвердили функциональность вектора, впоследствии использованного в экспериментах на собаках, и предположили, что экспрессия cFVIIa у мышей с НА, но в остальном иммунокомпетентных, не индуцировала ингибирующий иммунный ответ.

    Эффективность AAV-опосредованного переноса гена cFVIIa in vivo у собак с гемофилией А и В . (A) Вектор AAV8, используемый для инфузии мышам и собакам с гемофилией.Инвертированные терминальные повторы (ITR) фланкируют экспрессионную кассету, состоящую из промотора/энхансера hAAT/apoE, синтетического интрона, кДНК cFVIIa (с 5'-UTR и без метки HPC4) и сигнала полиаденилирования (pA) из бычьего гормона роста. . (B) ПВ и аЧТВ у мышей HA (n = 6) после введения в хвостовую вену AAV8-cFVIIa. Заштрихованная рамка представляет диапазон значений аЧТВ у нормальных (N) мышей, определенных по меньшей мере у 4 мышей. (C) WBCT после введения вектора AAV8-cFVIIa в портальную вену () у собак с HA и HB.Заштрихованная рамка представляет собой диапазон значений для нормальных собак. Вертикальная пунктирная линия представляет день 0. Профилактическое лечение плазмой проводилось в дни со 2 по 4 (HA-1-J55, HA-2-J57), со 2 по 5 (HA-3-E66) и с 1 по 5, а также в течение 2 дней после эпизодов неспонтанных кровотечений у собак с ГВ (происходящих на 11, 159 и 228 дни после введения ААВ). (D) PT после введения вектора AAV8-cFVIIa в портальную вену () у собак с HA и HB. Заштрихованная рамка представляет собой диапазон значений для нормальных собак. Вертикальная пунктирная линия представляет день 0.(E) экспрессия cFVIIa после введения вектора AAV8-cFVIIa в портальную вену () у собак с HA и HB. Заштрихованная рамка представляет собой диапазон значений для нормальных, HA и HB собак. (F) Время реакции (время до начального образования фибрина) при тромбоэластографическом анализе цельной крови у собак, получавших ГА, после инфузии вектора AAV8-cFVIIa (). Заштрихованная рамка представляет собой диапазон значений для нормальных собак.

    Поскольку доза вектора AAV8-cFVIIa, которая могла бы привести к гемостатической эффективности у собак с гемофилией, была неизвестна, мы первоначально ввели собаке мужского пола HB (HB-1-J10) 2.06E13 векторных геномов/кг через воротную вену (). Эта доза привела только к умеренному снижению WBCT и не изменила PT, что не было результатом иммунного ответа на cFVIIa (C, D; и данные не показаны). Эти наблюдения были сходными на протяжении всего периода наблюдения за этим животным (после 527-го изображенного дня до 34 месяцев, продолжающихся). Основываясь на этом результате, мы постепенно вводили все более высокие дозы AAV8-cFVIIa (3- или 6-кратно) собакам с ГА (). Собаки как с HA, так и с HB одинаково реагируют на инфузии rhFVIIa (Brinkhous et al 12 ; T. C.N., личное сообщение, август 2008 г.) и, таким образом, ожидалось, что они будут действовать аналогично после переноса гена AAV8-cFVIIa. У собак с ГА, получавших лечение AAV8-cFVIIa, наблюдалось начальное снижение WBCT и PT из-за профилактических инфузий нормальной собачьей плазмы (ежедневно в течение первых 4-5 дней после введения вектора, C и D, соответственно). Впоследствии мы наблюдали долгосрочное, стабильное снижение, намного меньше времени до инфузии как для WBCT, так и для PT (C и D соответственно). Это было результатом устойчивой экспрессии гена cFVIIa, которая колебалась между 1.3 и 2,6 мкг/мл ( P < 0,03 по сравнению с нормальными или нелеченными собаками с ГА; E). Как и ожидалось, у леченной собаки HB-1-J10, у которой не наблюдалось измеримого снижения PT, не наблюдалось изменения уровней антигена cFVIIa (E).

    Таблица 1

    Собаки гемофилии, используемые в этом исследовании

    фенотип Секс Секс Возраст в векторе на инфузии Вес на векторном инфузии, кг Векторная доза, векторные геномы / кг Всего вектор, векторные геномы
    HB-1-J10 HB Мужской 3 мес. 8.1 2.06e13 1.67e14
    Ha-1-J55 HA 11 MO 19.3 6.25E13 1.25E15
    HA-2-J57 Ха Женский 1.2 Y 21.1 21.1
    Ха HA 60258 6,5 y 20,0 1. 25E14 2.5e15 2.5e15

    Чтобы дополнительно продемонстрировать эффективность, мы провели тромбоэластографический анализ цельной крови собак, получавших ГА.Мы наблюдали значительно улучшенный профиль динамики сгустка (данные не показаны) и устойчивую почти нормализацию времени реакции (время до начального образования фибрина 26 ; P = 0,03 [HA-1-J55], P = 0,08 [HA-2-J57], P = 0,004 [HA-3-E66] по сравнению с нормальными собаками; F), значительно ниже значений HA ( P < 0,001 по сравнению с HA). У собак, получавших ГА, также наблюдалась почти нормализация максимальной амплитуды сгустка (данные не показаны). Подтверждая уровни антигена WBCT, PT и cFVIIa, собака, получавшая лечение HB-1-J10, продемонстрировала умеренное улучшение этих параметров тромбоэластографии по сравнению с контрольной группой, не получавшей лечения HB (данные не показаны).

    У собак с гемофилией, получавших лечение AAV-cFVIIa, не наблюдается эпизодов спонтанных кровотечений

    Поскольку у собак с гемофилией наблюдается примерно 5 или 6 эпизодов спонтанных кровотечений в год, 27,28 мы использовали количество спонтанных кровотечений в качестве клинически значимой конечной точки эффективности . У контрольных нелеченых собак с ГА и ГБ, которые одновременно наблюдались в рамках этого исследования, было зарегистрировано 12 и 21 спонтанное кровотечение за 36 и 60 кумулятивных месяцев наблюдения соответственно (1). В совокупности за 34 месяца (HB) и 45 месяцев (HA) наблюдения у собак, получавших AAV8-cFVIIa, не было никаких эпизодов спонтанного кровотечения, в отличие от ожидаемых 15 (HB) и 21 (HA) эпизодов ( P ). < .002 по сравнению с историческими данными в этой колонии собак 27,28 или парных параллельных контролей; ). У собаки с самой низкой дозой HB было 3 неспонтанных кровотечения в течение первых 8 месяцев после введения вектора AAV и каждое после гемостатической стимуляции (начальная операция по доставке вектора, биопсия печени, выполненная для изучения экспрессии cFVIIa, и собачьи бои; вводилась нормальная собачья плазма). ежедневно для каждого эпизода до 3 дней). Примечательно, что, несмотря на отсутствие заметных изменений в WBCT, PT или экспрессии cFVIIa у этой собаки (продолжающееся наблюдение в течение 34 месяцев), введение AAV8-cFVIIa в векторных дозах, которые не повышали уровни циркулирующего cFVIIa, приводило к измеримому фенотипическое воздействие.

    Стол 2

    Таблица 2

    Спонтанные кровотечения эпизоды в гемофилии, обработанные по гемофилии собаки и необработанные элементы управления HA и HB, записанные одновременно с этим исследованием

    Вектор, векторные геномы / кг Спонтанные кровотечения, наблюдаются / ожидается Месяцы наблюдения Нелеченный ГА, кровотечения/период наблюдения (мес. ) Нелеченный ГБ, кровотечения/период наблюдения (мес.)
    HB-1-J10 2.06e13 0/15 * Собака 1 (8/24) Собака 1 (4/12)
    HA-1-J55 6.25E13 0/8 18 Собака 2 (4/12) Собака 2 (9/24)
    Ha-2-J57 1.25E14 0/7 15 Собака 3 (8/24 )
    HA-3-E66 1. 25E14 0/6 12
    Совокупные спонтанные кровотечения
    12 в 36 мес 21 В 60 MO
    HB 0 в 34 MO
    HA 0 в 45 MO
    Ожидаемые спонтанные кровотечения 9 0258
    HB 15 в 34 МО
    HA 21 в 45 MO

    Безопасность долгосрочного выражения CFVIIA в AAV- обработанные гемофилией собаки

    Химический состав сыворотки для функций печени и почек до и после переноса генов тщательно контролировался на протяжении всего исследования. Были определены значения сывороточной креатинфосфокиназы, АР, общего билирубина, аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы, сывороточной глутамилпировиноградной трансаминазы, сывороточной глутамилоксалоуксусной трансаминазы и гамма-глутамилтранспептидазы, которые оказались в пределах нормы у всех собак (1). Уровни AP у собаки HB-1-J10 были незначительно повышены в течение первых 2 недель, но у этой собаки также был слегка повышен уровень AP даже до инфузии AAV (1). Количество тромбоцитов было в пределах нормы на протяжении всего исследования (А).Поскольку у мышей, непрерывно экспрессирующих mFVIIa на уровне более 2 мкг/мл, наблюдалась преждевременная смертность, 10 для дальнейшего изучения безопасности этого подхода к переносу генов мы использовали 3 различных анализа: уровни комплекса ТАТ, уровни D-димера (повышенные уровни которые являются индикаторами тромбоэмболической болезни и диссеминированного внутрисосудистого свертывания [ДВС-синдром] у собак 29,30 ), и уровни фибриногена, повышенные уровни которых связаны с сердечно-сосудистыми заболеваниями. 31 Мы не обнаружили каких-либо существенных изменений уровней ТАТ или D-димера по сравнению с введением до AAV ( P > .2) в любой из доз вектора, применявшихся у собак, получавших ААВ, на протяжении всего периода наблюдения (Б и С соответственно). Уровни фибриногена демонстрировали некоторую изменчивость во времени, и у 2 из 4 собак (HB-1-J10 и HA-1-J55) наблюдалось временное (продолжительностью ~ 1 неделя) повышение, возможно, из-за послеоперационного ответа на введенную анальгезию до и после. операция, как описано выше. 32 В любом случае анализ послеоперационных образцов, начавшийся через 1 неделю после последней профилактической инфузии нормальной собачьей плазмы, выявил уровни фибриногена, которые находились в пределах нормы для собак с ГА и ГБ ( P > .05 по сравнению с необработанным HB для собак HB; P > 0,12 по сравнению с необработанным ГК для собак HA-1-J55, HA-2-J57 и HA-3-E66; Д). Это согласуется с отсутствием значительных изменений наблюдаемых уровней D-димера (C). Наконец, как и ожидалось, все собаки, получавшие AAV, демонстрировали устойчивые антитела против AAV8, которые развивались в течение первых 4 недель после инфузии вектора и представляли собой преимущественно IgG2 (данные не показаны). Отмечено начальное падение лейкоцитов и после введения ААВ; однако это, вероятно, является результатом профилактического введения нормальной плазмы во время инфузии вектора.Только у одной собаки (HA-3-E66) наблюдалось кратковременное повышение уровня IgG к cFVIIa выше фонового на 7-й день после инфузии AAV, которое возвращалось к исходному уровню на 28-й день (данные не показаны). Это антитело не было ингибирующим, потому что WBCT все еще был ниже своего исходного уровня в течение всего этого периода, даже несмотря на то, что собака больше не получала обычную профилактику собачьей плазмой. В совокупности эти результаты дополнительно подтверждают долгосрочные гемостатические и фенотипические эффекты, наблюдаемые после переноса гена AAV8-cFVIIa, и указывают на то, что непрерывная экспрессия cFVIIa имеет превосходный профиль безопасности на протяжении всего исследования (34 месяца для собак с HB; 18 месяцев для HA). собаки [самое продолжительное индивидуальное наблюдение]).

    Таблица 3

    Serum Chemistries в AAV обработанной гемофилии собаки

    01
    день CPK 59-895 U / L AP 5-131 U / L SGPT 12-118 U / L SGOT 15-66 U / L Total BiliRubin 0.1-0.3 MG / DL GGTP 1.0-12 U / L
    HB-1-J10 собака
        Базовый уровень 340 134 37 33 0,2591 <5
    3 344 163 101 27 0,1 <5
    14 283 136 32 27 0,1 <5
    108 253 67 67 6 9 9 25 0,1 9 9
    297 145 45 45 23 0. 2 <5
    358 87 25 40 24 0,1 <5
    527 104 32 36 19 0,3 <5
    13 79 79 28 32 0. 1 <5
    3 207 81 65 37 0,2 <5
    93 133 48 72 41 0,2 <5
    296 80258 41 41 41 41 0. 2 <5
    435 100 29 71 31 9158 0.2 <5
    HA-2-J57 собаки
    Исходные 100 46 34 35 0,2 <5
    3 103 91 91 9 9 9 9 22 0. 2 <5
    86 116 41 47 44 0.2 <5
    275 80 22 31 24 0,2 <5
    470 107 41 47 27 0,3 <5
    554 131 33 87 35 0,2 <5
    HA-3-Е66 собаки <5
    3 243 47 98 49 0,1 <5
    6 177 41 68 36 0,1 <5
    105 131 15 5 9 55 3 9 0,1 <5
    30253 153 15 44 32 0. 1 <5 9 9 93 93 93 16 53 53 3 9 0,1 0,1 <5

    Безопасность непрерывного выражения CFVIIA . Количество тромбоцитов (PLT) (A), уровни TAT (B), D-димера (C) и фибриногена (D) показаны как функция времени после введения AAV8-cFVIIa (стрелка). День 0 обозначен пунктирной линией. Заштрихованный прямоугольник представляет собой диапазон значений для нормальных (N), HA или HB собак (за исключением панели D, где он указан для HA, N и HB отдельно).

    Обсуждение

    Генная терапия направлена ​​на лечение моногенных заболеваний, при которых взаимосвязь между переносом генов и фенотипическим улучшением является прямой. В частности, гемофилия очень хорошо охарактеризована как биохимически, так и на молекулярном уровне, и существуют обширные знания в отношении терапевтических вмешательств. Однако, несмотря на несколько клинических испытаний по переносу генов с использованием различных векторов и способов введения, 15 ни в одном из них еще не рассматривалась возможность такого подхода у пациентов с ингибиторами, у которых ранее существовавший иммунитет мог бы уменьшить терапевтическую экспрессию FVIII или FIX человека от вектор доставки.Чтобы решить эту проблему, мы ранее продемонстрировали, что перенос гена трансгена FVII, сконструированного для секреции в активированной форме, может нормализовать гемофильный фенотип у мышей. 9 Такой подход был бы особенно полезен для пациентов с гемофилией с ингибиторами, поскольку пациенты были бы толерантны к введенному трансгену (FVIIa). Таким образом, непрерывная экспрессия FVIIa обеспечивает функциональные и иммунологические преимущества, оказывая влияние на гемостаз как при ГА, так и при ГБ с ингибиторами или без них, а также при других нарушениях свертывания крови, что наблюдается при болюсном введении rhFVIIa.

    Здесь мы представляем доказательство концепции этого подхода к переносу генов с использованием непрерывной экспрессии собачьего FVIIa у собак с гемофилией. Эта крупная животная модель была хорошим прогностическим фактором эффективности при гемофилии с использованием ряда продуктов. 12–15 Однако, поскольку FVIIa является протеазой (в отличие от предыдущих подходов к переносу генов с использованием зимогена FVIII или FIX), актуальным является вопрос безопасности, особенно в отношении тромбоза. Таким образом, наше исследование было направлено на демонстрацию как эффективности, так и безопасности, и мы сообщаем о трех основных результатах исследования собак с гемофилией: (1) собачий FVII может быть сконструирован для секреции в биологически активной двухцепочечной форме; (2) постоянная экспрессия FVIIa на уровне примерно 2 мкг/мл (~40 нМ) может привести к заметному долгосрочному улучшению гемостатического диатеза, несмотря на лишь частичную коррекцию параметров гемостаза in vitro; и (3) при этих уровнях экспрессии и вводимых дозах вектора AAV8 мы не наблюдали гепатотоксичности или повышенного риска тромбоза.

    Что касается уровней экспрессии, необходимых для эффективности, наши результаты аналогичны результатам, полученным на мышах с гемофилией, трансгенных по мышиному FVIIa (mFVIIa), или после опосредованного AAV-mFVIIa переноса гена. 9,10 Введение дозы в диапазоне от 6,25 до 12,5E13 векторных геномов/кг приводило к устойчивой экспрессии cFVIIa от 1,5 до 2,5 мкг/мл, что приводило к супрафизиологическому снижению PT (как и ожидалось) и частичному или почти коррекция показателей лейкоцитарной и тромбоэластографии соответственно.Это говорит о том, что в обеих животных моделях гемофилии гемостатическая эффективность может быть достигнута на уровнях, сравнимых с болюсным введением rhFVIIa людям. Однако эффективная доза вектора у собак с гемофилией была в 2-5 раз выше, чем дозы, необходимые для мышей, что напоминает аналогичные результаты для cFVIII или cFIX. 33,34 Таким образом, это наблюдение оправдывает использование этой модели на крупных животных в доклинических исследованиях переноса генов с использованием FVIIa в качестве предиктора эффективности у людей; Стоит отметить, что собаки, в отличие от мышей, предсказывали правильную дозировку в исследовании печени человека с использованием вектора FIX AAV-человека. 35 Кроме того, отсутствие клинически значимых конечных точек в исследованиях на мышах, таких как эпизоды спонтанного кровотечения, наблюдаемые у собак с гемофилией, еще больше подчеркивает ценность собачьей модели гемофилии. Действительно, мы наблюдали полное отсутствие спонтанных кровотечений у собак с гемофилией, получавших AAV, на протяжении всего этого исследования, явное улучшение кровоточащего диатеза. Сопоставимые результаты можно было бы ожидать после AAV-опосредованного переноса гена cFVIIa у собак с гемофилией с ингибиторами, 36 аналогичные фенотипическому улучшению, продемонстрированному у мышей с гемофилией с ингибиторами hFVIII после трансплантации генетически модифицированных тромбоцитов, экспрессирующих mFVIIa. 37

    Очевидное улучшение геморрагического диатеза имеет особое клиническое значение в отношении применения этого подхода к переносу генов на людях. Основная заболеваемость больных гемофилией связана с повторными кровоизлияниями в суставы. 38 Если они являются результатом повреждения микроокружения сустава, возможно, непрерывная экспрессия FVIIa может привести к уменьшению количества суставных кровотечений. Ранее мы показали, что непрерывная экспрессия mFVIIa на уровне 0.От 5 до 1,5 мкг/мл у мышей с гемофилией приводили к восстановлению гемостаза после гемостатической стимуляции в микроциркуляторном русле, но не в крупных сосудах. 10 Таким образом, возможным объяснением отсутствия спонтанных кровотечений (включая кровотечения из суставов) в этом исследовании может быть то, что непрерывная экспрессия FVIIa обеспечивает «защитный» и локализованный гемостатический эффект, особенно в микроциркуляторном русле. Удивительно, но, несмотря на отсутствие заметных изменений параметров гемостаза и уровней cFVIIa у леченных собак с HB после инфузии низких доз AAV8-cFVIIa, мы наблюдали только 3 неспонтанных кровотечения в течение первых 8 месяцев после введения вектора за период наблюдения 34 месяца. .Аналогичные результаты у собак с ГА, получавших низкую дозу вектора, можно ожидать, учитывая сходство этих двух моделей гемофилии в ответ на инфузии rhFVIIa. 12 Тот факт, что AAV-опосредованный перенос гена FVIIa в низкой дозе вектора может принести некоторую клиническую пользу, безусловно, требует дальнейшего изучения на модели собак, поскольку он будет безопасным и может иметь потенциальное применение в профилактике. Такие эксперименты на собаках, которые в настоящее время проводятся, помогут определить самые низкие уровни экспрессии, которые приводят к измеримому клиническому улучшению.

    Важным наблюдением у мышей с гемофилией, трансгенных по mFVIIa, была преждевременная смертность мышей, непрерывно экспрессирующих mFVIIa на уровне более 2 мкг/мл. 10 Поскольку модель гемофилии у собак является хорошим прогностическим фактором эффективности лечения гемофилии, поэтому в этом исследовании, где FVIIa постоянно экспрессируется, было уместно тщательно изучить возможность тромбоэмболических заболеваний, ДВС-синдрома и гепатотоксичности. Уровни ТАТ и D-димера на протяжении всего исследования находились в пределах нормы у собак с HA/HB, даже у собак, которые получали самую высокую дозу вектора (HA-2-J57, HA-3-E66), что позволяет предположить, что непрерывная экспрессия FVIIa на указанных здесь уровнях не приводит к прокоагулянтному состоянию. Это хорошо согласовывалось с частичной коррекцией их показателей гемостаза in vitro. Возможность системной коагуляции потребления оценивалась с использованием количества тромбоцитов, уровней D-димера и фибриногена, биомаркеров, используемых для диагностики ДВС-синдрома, 39 , все из которых были отрицательными. Наконец, мониторинг ферментов печени не выявил каких-либо признаков гепатотоксичности и впервые продемонстрировал, что дозы вектора AAV8 до 2,6 генома вектора E15 хорошо переносятся у собак с гемофилией.

    Важным наблюдением текущего исследования является то, что уровень экспрессии, необходимый для эффективности, выше по сравнению с аналогичными подходами к лечению гемофилии на основе AAV, направленными на печень, с использованием cFVIII или cFIX, где фенотипическое улучшение наблюдалось всего лишь на 4%. до 9 % cFVIII (4–20 нг/мл, 33,40 , при условии, что 100–200 нг/мл соответствует 100 %) или 5 % cFIX (∼ 250 нг/мл, 22 , при условии, что 100%). Следовательно, используемые здесь дозы вектора AAV8 были выше, чем дозы, используемые для AAV8-cFVIII (1E13 векторных геномов/кг 40 ) или AAV8-cFIX (5.25E13 векторных геномов/кг 41 ). Впрочем, это неудивительно; рекомбинантный FVIIa имеет значительно более короткий период полураспада (~ 2,5 часа 42 ), чем рекомбинантный FVIII (~ 12 часов 43 ) или FIX (~ 19 часов 44 ), и фармакологические уровни, необходимые для гемостатической эффективности, выше (поскольку показано болюсным введением rhFVIIa по сравнению с рекомбинантным FVIII или FIX). Очевидно, что стратегия снижения эффективной дозы вектора может быть желательной, и в настоящее время она осуществляется с использованием комбинации улучшенных векторов AAV 45 , а также оптимизации содержания гуанина-цитозина, цис-регуляторных элементов и использования кодонов. 46 Более того, в дополнение к улучшениям на уровне ДНК, изменения на уровне белка также могут быть реализованы с использованием высокоактивных вариантов FVIIa. 47,48

    В заключение, наши данные демонстрируют, что направленный на печень AAV8-опосредованный перенос гена cFVIIa у собак с HA и HB является безопасным в краткосрочной и среднесрочной перспективе и приводит к заметному и устойчивому фенотипическому улучшению. Хотя обычный перенос гена гемофилии основан на доставке FVIII или FIX для терапевтической экспрессии, это первое доказательство концепции доставки обходного агента FVIII/FIX на основе гена в модели гемофилии у крупных животных.Этот подход имеет потенциальное применение не только для генной терапии гемофилии, но и для лечения нарушений тромбоцитов, дефицита FVII или профилактики врожденной гемофилии, осложненной ингибиторами, как это было описано для rhFVIIa. 8

    Авторство

    Вклад: P.M. разработал и провел исследование, проанализировал данные и написал статью; ER провел исследование и проанализировал данные; М.Н.А. и HDD проведенное исследование; У.Г. работал на собаках с дефицитом FVII и предоставил собачью плазму с дефицитом FVII; С. З. предоставил препарат вектора AAV; Э. М. и А. Д. проводили исследования; ME предоставила реагенты и оказала помощь в разработке анализа антигена cFVIIa; Т.С.Н. проведены исследования и проанализированы данные; и К.А.Х. разработал исследование и написал статью.

    Раскрытие информации о конфликте интересов: M.E. является сотрудником Novo Nordisk A/S. Остальные авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

    Корреспонденция: Кэтрин А. Хай, Уильям Х. Беннетт, профессор педиатрии, исследователь, Медицинский институт Говарда Хьюза, Детская больница Филадельфии, 3615 Civic Center Blvd, 302 Исследовательский центр Абрамсона, Филадельфия, Пенсильвания 19104; электронная почта: уде[email protected]

    Почему происходит расслоение брюшной полости и как это лечится

    ИСТОЧНИКИ:

    Клиника Майо: «Почему мышцы живота иногда расходятся во время беременности?»

    Академические словари и энциклопедии: «Диастаз прямых мышц живота».

    Джули Таплер, RN, сертифицированный консультант по акушерству, сертифицированный личный тренер, Нью-Йорк; основатель DiastasisRehab. com.

    Boissonnault, J. Physical Therapy , 1988.

    Chiarello, C. Journal of Women's Health Physical Therapy , весна 2005.

    Lee, D. Journal of Bodywork and Movement Therapies , октябрь 2008 г.

    Keeler, J. Journal of Women's Health Physical Therapy , сентябрь/декабрь 2012 г. .

    Gilleard, W. Физическая терапия , июль 1996.

    Шеппард, С. 9093 Ручная терапия , сентябрь 1996.

    Coldron, Y. Ручная терапия , апрель 2008.

    Локсенд, Т. Пластическая и реконструктивная хирургия , май 1998 г.

    Барбоза, С. Архив гинекологии и акушерства , август 2013 г.

    Эрика Зиль, сертифицированный тренер по пилатесу, сертифицированный персональный тренер, основатель Knocked-Up Fitness; основатель Core Athletica Inc., Ньюпорт-Бич, Калифорния; автор, The Knocked-Up Fitness Guide to Premancy , 2014.

    Bursch, S. Physical Therapy , июль 1987. Международный журнал урогинекологии и дисфункция тазового дна , март 2007 г.

    Benjamin, D. Physiotherapy , March 2014.

    Spence, M. The Australian Journal of Physiotherapy , 1978. Palanivelu, C. Hernia , июнь 2009 г.

    Van de Water, A. Archives of Gynecology & Obstetrics , January 2014.

    Boxer, S. Australian Journal of Physiotherapy

    , P.

    , 1997. .

    Мануальная терапия , август 2013 г.

    Мота, стр. Журнал ортопедической и спортивной физиотерапии , ноябрь 2012 г.

    Хикки, Ф. Грыжа , декабрь 2011 г. Ректи."

    Nahas, F. Эстетическая пластическая хирургия , февраль 2011 года.

    Кульханек, Дж. грыжа , август 2013 года.

    Вериссимо, С. Эстетическая пластическая хирургия , апрель 2014 года.

    Тадипарти, С. Journal of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery , March 2012.

    de Castro, E. Plastic and Reconstructive Surgery , August 2013.

    Mestak, O. Plastic and Reconstructive Surgery , November 2013.

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.